Как считают тромбоциты в крови. Подсчет тромбоцитов по методу фонио

19.07.2019

Определение числа тромбоцитов - важнейший метод исследования, способный обнаружить наиболее частое нарушение гемостатического потенциала крови - тромбоцитопению. В настоящее время для определения числа тромбоцитов имеется несколько лабораторных технологий (автоматизированный, по Фонио и др.). Наибольшую точность имеет микроскопический метод при подсчете в камере, однако этот метод требует от врача-лаборанта опыта, напряжения зрения, концентрации внимания.

Принцип метода

Принцип метода основан на определении числа тромбоцитов путем их подсчета в камере Горяева обычной световой микроскопией или с помощью микроскопа с фазово-контрастной приставкой после разведения крови и гемолиза эритроцитов раствором оксалата аммония.

С целью повысить точность микроскопического метода число тромбоцитов подсчитывают в двух камерах, затем вычисляют среднюю арифметическую.

Реактивы и оборудование

1% раствор оксалата аммония.
Смеситель Сали.
Камера Горяева (2 шт.).
Световой микроскоп с увеличением х 40 или микроскоп с фазово-контрастной приставкой (например, КФ-4 или др.).

Образцы крови для исследования

Определение числа тромбоцитов возможно в крови, стабилизированной цитратом натрия или нанесенным на стенки пластиковой пробирки мелкодисперсным порошком этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). При использовании микроскопического метода предпочтительнее брать кровь на цитрате натрия, чтобы исключить влияние ЭДТА на результаты подсчета тромбоцитов.

Техника выполнения

В сухую пластиковую пробирку вносят 1,98 мл 1% оксалата аммония и 0,02 мл крови. Медленно и аккуратно перемешивают смесь в течение 2 мин, а затем ее инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре. Далее заполняют две камеры Горяева содержимым пробирки и на 10 мин помещают их в чашку Петри, в которой находится влажная марля или смоченный фильтр. После этой инкубации, которая необходима для оседания тромбоцитов, подсчитывают их число в 25 квадратах. Среднюю арифметическую результатов подсчета в двух камерах умножают на 1000. При исследовании цитратной крови результат увеличивают на 10 % и умножают на 1000, что позволяет корректировать разведение венозной крови раствором натрия цитрата.

Оценка результатов исследования

У здорового человека число тромбоцитов в периферической крови колеблется в довольно широком диапазоне - от 150 до 400 х 109/л.

Недопустимо исследование числа тромбоцитов в охлажденных образцах крови. При гемолизе возможно занижение числа тромбоцитов. В ряде случаев при исследовании числа тромбоцитов на гематологических анализаторах встречается так называемая псевдотромбоцитопения, обусловленная агрегацией и группировкой тромбоцитов в присутствии ЭДТА. Эту проблему решает забор крови на цитрате натрия.

Для обеспечения контроля качества при подсчете числа тромбоцитов на гематологических анализаторах существуют контрольные образцы с разным содержанием этих клеток. О возможности использования этих образцов для обеспечения контроля качества при подсчете числа тромбоцитов микроскопическим методом не существует общепринятых рекомендаций. Для повышения точности результатов микроскопического исследования следует периодически контролировать воспроизводимость результатов определения числа тромбоцитов разными лаборантами в течение рабочего дня и на основе полученных данных повышать точность и снижать вариацию при выполнении этой методики Коэффициент вариации микроскопического метода у опытных лаборантов не превышает 10 %.

Интерпретация результатов исследования

В клинической картине тяжелого течения идиопатической тромбоцитопенической пурпуры доминирует геморрагический синдром. При вторичных тромбоцитопениях геморрагический синдром, как правило, умеренный, и сочетается с клиническими симптомами основного заболевания, обусловившими тромбоцитопению. В тех случаях, когда число тромбоцитов менее 100 х 109/л длительно наблюдается без каких-либо проявлений фонового заболевания, следует думать об идиопатической тромбоцитопенической пурпуре.

Тромбоцитозы также наблюдаются при миелопролиферативных заболеваниях. Нередко на фоне миелопролиферации отмечают нарушения реологических свойств крови за счет полиглобулии. В последнем случае, а также при числе тромбоцитов более 700 х 109/л у пациентов повышается риск тромбозов. Однако на фоне миелопролиферативных заболеваний, сопровождающихся тромбоцитозом более 1500 х 109/л, парадоксально наблюдается геморрагический синдром.

При тромбоцитопении и наличии геморрагического анамнеза с раннего детского возраста весьма важно оценить размер тромбоцитов, в т. ч. MPV (средний объем) в мазке крови, а также наличие каких-либо включений в тромбоциты.

Причины ошибок

Использование одной камеры, меньшее число подсчитываемых квадратов.
Неточность градуировки разных смесителей.
Ошибки преаналитического этапа исследования, в т. ч. неправильная дозировка цитрата при заборе венозной крови.
Недостаточная квалификация лаборанта.

Другие аналитические технологии

Практически все гематологические анализаторы неплохо измеряют число эритроцитов и лейкоцитов в крови, хорошие результаты точности и воспроизводимости демонстрирует метод определения концентрации гемоглобина, реализованный в таких приборах. Однако и в настоящее время еще встречаются образцы анализаторов, которые число тромбоцитов при тромбоцитопениях подсчитывают неточно, и, как правило, наблюдается завышение числа тромбоцитов при их автоматизированном подсчете. Особенно ярко этот недостаток проявляется при работе с образцами крови, в которых число тромбоцитов ниже 50 х 109/л. Этот недостаток есть следствие того, что тромбоциты гораздо мельче других клеток крови, поэтому сложнее выполнить их корректный подсчет в той же камере и такими же техническими приемами, что и другие клетки крови. Следует отметить также, что на показатели точности подсчета тромбоцитов на гематологическом анализаторе весьма существенное влияние оказывают качество и надежность используемых калибраторов. Именно поэтому в сложных диагностических ситуациях или при глубокой тромбоцитопении в анамнезе для уточнения числа тромбоцитов следует применять микроскопический метод.

Подсчет клеток крови в окрашенных мазках имеет низкую точность и воспроизводимость, поэтому он не может быть рекомендован для применения в современных клиниках.

Тромбоциты по Фонио – это наиболее распространенный и достоверный способ подсчета количества маленьких кровяных пластинок, которые образуются в костном мозге. Особенностью такого теста является то, что форменные элементы крови учитываются не в жидком виде, а в окрашенном мазке.

Такой анализ не имеет ограничений по половой принадлежности и возрастной категории, отчего является разрешенным для детей и представительниц женского пола в период беременности.

Для получения наиболее достоверной информации необходимо соблюдение нескольких несложных правил подготовки, о которых гематолог заранее предупреждает каждого больного.

Необходимость осуществления такого лабораторного теста заключается не только в том, чтобы выявить повышенное или пониженное содержание тромбоцитов в крови, но также для контроля над эффективностью терапии.

Преимущества метода

В настоящее время существует несколько методик подсчета уровня тромбоцитов: люминесцентная микроскопия, использование электронно-автоматических счетчиков, применение камеры Грязева. Однако в подавляющем большинстве случаев применяется именно метод по Фонио.

Положительные стороны такого исследования:

высокая точность – достигается благодаря использованию специальной формы расчета, компоненты которой легко обнаруживаются в капле крови;
быстрота осуществления – промежуток времени с момента забора биологического материала и до получения результатов составляет не более 2 часов, а с применением новейшего высокоточного оборудования вся процедура занимает не более получаса;
отсутствие необходимости в дорогостоящих реактивах – для активации тромбоцитов достаточно введения коагулянтов, а также проводится подкрашивание мазка специальным раствором.

Именно такие факторы дают возможность получить более точную информацию, нежели при общеклиническом анализе крови или коагулограмме.

Кроме этого, подсчет тромбоцитов по Фонио обладает следующими особенностями:

хорошая визуализация клеточных элементов;
изучение биологического материала может быть проведено в любое время, а не сразу же после получения крови;
вычисление уровня мелких кровяных пластинок облегчено их «привязкой» к 1000 эритроцитов на 1 миллилитр крови.

Однако подобная методика может иметь погрешности, которые связаны с плохим качеством мазка или неравномерным распределением тромбоцитов по специальному стеклу.

Факторы, влияющие на качество анализа

Специалисты из области гематологии, занимающиеся расшифровкой результатов, выделяют несколько основных факторов, которые могут очень сильно повлиять как на качество, так и на исход анализа.

Прежде всего, необходимо отметить, что существует специфическая подготовка к подобному лабораторному тесту:

Кровь не берется у пациента, находящегося в состоянии алкогольного опьянения, поскольку на этом фоне норма тромбоцитов повышается в 3-4 раза.
Исследование не осуществляется при сильной физической усталости человека, а также в случае длительного влияния стрессовых ситуаций. Такие расстройства могут вызвать чрезмерную выработку форменных элементов, что является исключительно временным явлением и не несет в себе никакой информации о реальном положении вещей.
Анализ выполняют на голодный желудок.
За неделю до посещения врача необходимо полностью отказаться от приема каких-либо медикаментов. Если по каким-либо причинам сделать это невозможно, то следует проинформировать об этом клинициста.

Оптимальным временем для взятия образца являются утренние часы, а именно: с 7 до 9 утра.

Второе условие, влияющее на результат – качество реактивов. При применении некачественных веществ будут получены ложноположительные отклонения от нормы. В таких ситуациях человеку необходимо сдавать тест трижды, с промежутком в 2-3 суток. Это даст возможность свести к минимуму любые погрешности.

Помимо этого, учитываются особые состояния организма, а именно:

протекание менструации;
период вынашивания ребенка;
грудное вскармливание;

Именно такие обстоятельства приводят к тому, что результативность методики по Фонио значительно понижается.

Ход процедуры

Подсчет тромбоцитов по методу Фонио предусматривает окрашивание мазка крови специальным красителем. Подобные форменные элементы крови рассчитываются на 1000 эритроцитов, после чего переводятся в соотношение на 1 литр крови.

Реактивами, применяемыми во время такого теста, выступают:

сульфат магния 14% раствор;
краситель Романовского-Гимзы;
фиксаторы Лейшмана и Май-Грюнвальда.

Перед тем как нанести то или иное вещество на кожный покров пациента, необходимо его предварительно обработать. Для забора крови из пальца делается небольшой прокол. При изучении не используется первая капля крови. После этого наносится небольшая капля раствора одного из вышеуказанных веществ и осторожно смешивается. Из получившегося соединения делают мазок для последующего изучения. Стоит отметить, что кровь высушивается и окрашивается по методу Паппенгейма.

Далее предметное стекло помещают под микроскоп и снижают количество красных кровяных телец до тысячи. Во внимание берутся только близлежащие клетки, формирующие между собой группы. Единичные включения не имеют никакой ценности при таком исследовании.

После получения необходимого уровня эритроцитов параметры тромбоцитов рассчитывают по следующей формуле – Х=АхВ, а полученное число делят на 1000, где:

Х – это искомое количество тромбоцитов;
А – число кровяных пластинок в мазке на тысячу эритроцитов;
В – концентрация красных кровяных телец в литре крови;
1000 – показатель эритроцитов в исследуемом мазке.

Второй вариант действий лаборанта заключается в том, что в пробирку с капиллярной кровью вносят определенное количество магнезии или ЭДТА, тщательно перемешивают и готовят мазок. Затем смесь высушивается и окрашивается одним из вышеуказанных красителей. Формула расчета остается неизменной.

Именно такими способами определяется норма тромбоцитов как у взрослого человека, так и у ребенка.

Показатели нормы и отклонения от нее

Тромбоциты по Фонио норма будет немного отличаться в зависимости от влияния нескольких факторов, а именно: половой принадлежности и возрастной категории человека.

Установленный допустимый уровень описываемого компонента крови на 1 куб. миллиметр крови варьируется от 120 до 400 тысяч.

Варианты нормы:

Как повышенные, так и пониженные значения укажут специалисту на то, что в организме человека протекает тот или иной патологический процесс.

Если тромбоциты по Фонио снижены, то это в подавляющем большинстве случаев указывает на наличие следующих патологий:

лучевая болезнь;
острое отравление химическими веществами или ядами;
коллагеноз;
патологии кроветворной системы;
злокачественные новообразования любой локализации;
малокровие;
поражение печени;
различные аллергические реакции;
обильные кровопотери;
инфекционные недуги;
передозировка медикаментами;
хронический алкоголизм.

Когда анализ показал возрастание подобного элемента, то наиболее часто это указывает на:

Для установления окончательного результата потребуются дополнительные лабораторные тесты, инструментальные процедуры и консультации клиницистов из различных областей медицины.

Повышенные и пониженные тромбоциты по Фонио требуют коррекции, что основывается на ликвидации базового заболевания или предрасполагающего фактора, не имеющего отношения к протеканию какого-либо недуга, например, алкоголизм или передозировка медикаментами.

Для восстановления нормального уровня необходимо:

принимать лекарственные препараты с обязательным контролем суточной нормы и длительности приема;
использовать рецепты народной медицины – показано только после одобрения лечащего врача;
соблюдать определенные правила питания;
полностью отказаться от вредных привычек.

В любом случае терапия будет носить индивидуальный подход. Однако полный отказ от квалифицированной помощи влечет за собой развитие осложнений, которые иногда несут угрозу для жизни человека.

Общий анализ крови позволяет получить ценную диагностическую информацию. Часто в лабораториях используют автоматические гематологические счетчики, позволяющие оценить количество лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов и некоторых других форменных элементов крови. Несмотря на удобство проведения автоматического подсчета, наиболее информативными считаются методы микроскопического исследования. Один из них – тромбоциты по Фонио.

Что такое тромбоциты

Тромбоцитами называют безъядерные клетки крови, которые синтезируются тканями красного костного мозга. Цикл их жизнедеятельности составляет около 7 суток, после чего они утилизируются в печени и селезенке. У тромбоцитов процесс старения выражен более, чем у других форменных элементов крови.

Как и другие составляющие крови, тромбоциты делятся на молодые, зрелые и старые. У здорового человека количество зрелых клеток не должно превышать 95%. Если при анализе обнаруживается большая концентрация молодых телец, это свидетельствует о развитии некоторых заболеваний, среди которых можно назвать многочисленные повреждения кровеносных сосудов и прочее. Кроме молодых, в плазме крови нередко обнаруживаются старые тромбоциты. Такое явление говорит о нарушении процесса производства и утилизации клеток.

Роль в организме

Тромбоциты принимают активное участие в процессах, связанных с образованием тромбов. Они также производят специальное вещество, необходимое для регенерации тканей, стимуляции деления клеток, регулировки уровня проницаемости клеточных мембран и поддержания эластичности сосудов.

Ценное значение количественный и качественный состав тромбоцитов имеет при диагностике заболеваний сердца и сосудов. Высокое количество этих телец называется тромбоцитозом, пониженное – тромбоцитопенией.

Важно! В зависимости от возраста клетки имеют разную степень окрашивания, что дает возможность использовать этот морфологический признак для проведения дифференциальной диагностики.

В чем заключается метод Фонио

Подсчет тромбоцитов по Фонио – это анализ, помогающий выявить точное количество этих телец в крови, диагностировать многие заболевания у человека. При этом подсчет тромбоцитов осуществляется в мазке крови на тысячу эритроцитов, после чего это число пересчитывается в соотношении на 1 микролитр или литр. Методика считается очень точной, применяется для диагностики многих патологий.

Во время анализа кровь окрашивается по методу Романовского-Гимзе

Для проведения анализа кровь берется из пальца. Общее количество тромбоцитов в единице крови называется коагулограммой. Этот вид исследования назначают каждому пациенту, ведь анализ помогает заподозрить и выявить многие болезни.

Подготовка к анализу

На результат анализа тромбоцитов по Фонио могут повлиять некоторые факторы. В связи с этим необходимо правильно подготовиться к сдаче крови. Пациенту накануне перед забором биологического материала следует учесть следующие рекомендации:

сдача крови должна проводиться через 8 часов после последнего приема пищи, так как многие продукты способны повлиять на цветовой показатель форменных элементов крови;
накануне перед анализом нельзя заниматься спортом. Если человек выполнял любые физические нагрузки, результат исследования может быть неточным;
забор материала осуществляется в утреннее время;
наиболее точную информацию можно получить при сдаче крови повторно. Это помогает проследить за концентрацией тромбоцитов в динамике.

Кроме этого, врачу следует обязательно сообщить, принимались ли до этого какие-либо медикаментозные средства. Многие лекарства также способны исказить результат.

Подсчет тромбоцитов по Фонио

При подсчете тромбоцитов лаборант применяет несколько видов реактивов. Это этилендиаминтетраацетат натрия или сульфат магния. Реактивы берутся с помощью пипетки СЕЭ-метра.

Анализ проводится в несколько этапов:

В пробирку добавляют один из реактивов и кровь с помощью пипетки. Количество реактива берется до отметки 75, объем крови – до отметки К.
Полученную массу хорошо перемешивают и используют для изготовления мазков.
Если применяется магния сульфат, мазок окрашивается по методу Романовского-Гимзе на протяжении 120 минут и 45 минут, если лаборант берет этилендиаминтетраацетат натрия. При этом тромбоциты окрашиваются в фиолетово-розовый цвет.

Подсчет тромбоцитов проводят через микроскоп

С помощью микроскопа производится подсчет тромбоцитов и эритроцитов до тысячи красных телец крови. Чтобы узнать количество тромбоцитов, их умножают на число эритроцитов в 1 микролитре, после чего делят полученную цифру на тысячу. Получить наиболее достоверные результаты помогает специфический окрас исследуемых клеток. Именно поэтому многие специалисты при постановке диагноза используют метод подсчета тромбоцитов по Фонио.

Преимущества методики

Способ подсчета эритроцитов по Фонио успешно применяется многими врачами на протяжении многих лет. Техника имеет ряд преимуществ, среди которых выделяют:

при рассмотрении крови под микроскопом лаборант четко видит исследуемый материал, цвет, форму, число клеток;
при необходимости анализ можно проводить в любое время суток;
метод прост в использовании, что связано с простой формулой, но в то же время очень информативен.

Важно! Несмотря на то что медицина не стоит на месте и на сегодняшний день существуют новые методики подсчета частиц крови, метод Фонио не уступает им в своей точности и информативности.

О чем могут свидетельствовать низкие показатели

Тромбоцитопения или пониженная концентрация эритроцитов в крови у человека свидетельствует о развитии различных нежелательных состояний. К наиболее частым причинам низких показателей относят:

радиационное облучение больного;
воздействие на организм свинца и прочих вредных веществ;
патологии системы кроветворения;
коллагенозы у пациента (совокупность заболеваний, касающихся соединительной ткани);
наследственную предрасположенность;
хронический нефрит.

У больных с тромбоцитопенией наблюдаются такие клинические проявления, как частые носовые кровотечения, кровоточивость десен, подкожные геморрагии. У женщин заболевание проявляется в виде обильных и длительных месячных.

Тромбоцитопения вызывает склонность к кровоточивости

Лечение такого состояния подразумевает устранение основной причины, повлекшей за собой нарушение. При этом используется терапия с помощью медикаментозных средств. В особо тяжелых случаях проводится удаление селезенки или трансплантация костного мозга.

Причины повышенных показателей

При повышении числа рассматриваемых клеток на единицу крови речь идет о тромбоцитозе. Как правило, это вторичная патология, возникающая на фоне следующих состояний:

лечение с помощью некоторых медикаментов;
перенесенное оперативное вмешательство;
удаление селезенки;
обильные кровопотери;
воспаление оболочки головного мозга;
патологии почек и печени;
развитие онкологических образований;
железодефицитная анемия.

Наибольшая опасность тромбоцитоза заключается в образовании кровяных сгустков, способных закупоривать артерии. Это нередко ведет к инфарктам, инсультам и другим опасным заболеваниям.

Норма клеток у различных групп населения

При проведении анализа по методу Фонио используется норма от 120 до 400 тыс. клеток в кубическом миллиметре исследуемого материала. Колебание границ зависит от возраста пациента и его половой принадлежности. У женщин, мужчин и детей отклонения в пределах этих границ считаются нормой.

Нормальные показатели:

дети до года – от 100 до 420 тыс. на мм 3 ;
дети от года – от 180 до 320 тыс. на мм 3 ;
мужчины – от 180 до 400 тыс. на мм 3 ;
женщины от 180 до 340 тыс. на мм 3 .

У подростков уровень тромбоцитов может снижаться до 70 тыс. на мм3. У мужчин максимальное количество этих телец отмечается в возрасте 40 лет. Такие отклонения обязательно учитываются при постановке диагноза, объясняются физиологическими и возрастными особенностями организма.

Что влияет на уровень тромбоцитов в крови

Уменьшение или рост рассматриваемых клеток не всегда свидетельствует о развитии какой-либо патологии. Иногда уровень этих телец колеблется вследствие интенсивных и регулярных физических нагрузок, при неправильном питании. Многим людям может показаться странным тот факт, что при потере крови уровень тромбоцитов возрастает. Это объясняется попыткой организма компенсировать потерю крови повышенной выработкой ее форменных элементов.

Стрессы и вредные привычки могут повлиять на уровень тромбоцитов в крови

Часто показатели повышены у людей, употребляющих алкоголь на протяжении длительного времени. Нарушается норма тромбоцитов во время приема медикаментов с тромбоцитопеническим действием. Повлиять на результаты анализа может даже безобидное кровотечение из носа.

Методы нормализации показателей

Первое, что нужно сделать при обнаружении повышенных или пониженных показателей тромбоцитов в крови, это провести дальнейшее обследование пациента с целью выявления патологии, повлекшей за собой такое состояние. Главный метод терапии тромбоцитопении и тромбоцитоза – борьба с первопричиной. Если же нарушение развивается по безобидным причинам, повысить количество тромбоцитов можно с помощью таких способов:

отказаться от вредных продуктов, исключить из рациона алкогольные напитки, красный виноград, зеленый чай, чернику, томаты;
включить в ежедневный рацион яблоки, гречневую кашу, рыбные блюда, болгарский перец, печень;
по назначению специалиста принимаются специальные медикаментозные средства;
повысить количество клеток помогут витамины группы А, В и С.

Понизить концентрацию рассматриваемых элементов крови поможет отказ от экстремальных видов спорта, адекватная оценка стрессовых ситуаций, избегание конфликтов дома и на работе.

Для снижения тромбоцитов специалисты рекомендуют выполнять следующие правила:

принимать ацетилсалициловую кислоту в соответствии с назначением лечащего врача;
исключить из питания шиповник, гранат, манго и другие блюда, которые повышают уровень тромбоцитов;
пить препараты магния курсами несколько раз в год;
употреблять не менее полутора литров воды в сутки.

Подсчет тромбоцитов по методу Фонио – это один из наиболее точных методов исследования крови. С помощью такого анализа врач может выяснить многие патологии, подобрать соответствующее лечение для пациента. Проводится этот анализ также с профилактической целью, что необходимо для ранней диагностики заболеваний и недопущения развития серьезных последствий на их фоне.

Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:

Предметные стекла простые и шлифованные.
Смесители для эритроцитов.
Камеры Горяева.
Микроскопы.
Микроскоп с фазовоконтрастным устройством.
Черная бумага.
Ножницы.
Осветитель для микроскопа.
Сернокислый магний (MgS04).
Кокаин.
Хлористый натрий.
Лимоннокислый натрий.
Дистиллированная вода.
Метиловый спирт или смесь Никифорова (смесь равных частей 96° этилового спирта и эфира).
Основной раствор краски Романовского.
Иммерсионное масло.
Набор инструментов для укола в палец.

Тромбоциты - это небольшие образования величиной 2-3 мю. В них различают периферическую часть, напоминающую цитоплазму (гиаломер), и центральную зернистую часть, похожую на ядро (грануломер). Морфологические особенности гиаломера и грануломера зависят от возраста и состояния организма.

Для подсчета тромбоцитов требуются следующие реактивы:

14% раствор сернокислого магния (MgS04): 14 г MgS04 помещают в колбу на 100 мл и доливают дистиллированной водой до метки 100 мл. Раствор магнезии может быть заменен 5% раствором лимоннокислого натрия [(приготовление см. статью « »]. Эти реактивы препятствуют склеиванию тромбоцитов.
Реактив для подсчета тромбоцитов в счетной камере Горяева: 3 г кокаина и 0,4 г хлористого натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

Взятие крови для подсчета тромбоцитов в мазке

Подсчет в крови тромбоцитов производят по указанию врача. На очищенный спиртом и эфиром палец больного помещают каплю стерильного 14% раствора сернокислого магния или 5% раствора лимоннокислого натрия и через каплю реактива делают укол в палец. Выступившую каплю крови смешивают с помощью парафинированной стеклянной палочки или пастеровской пипетки с реактивом, готовят мазки крови и окрашивают их в течение 40-60 минут краской Романовского, разведенной на нейтральной дистиллированной воде так же, как для мазков крови.

Тромбоциты окрашиваются в розовато-фиолетовый цвет. Параллельно в смеситель берут кровь для подсчета эритроцитов (см. тему « »).

Подсчет тромбоцитов производят с ограничителем поля зрения (по Фонио). Для этого из кусочка бумаги вырезают кружок, по размеру равный 15-копеечной монете, складывают пополам и вчетверо, вершину конуса срезают, в результате чего в центре круга образуется «окошко» (рис. 35). Ограничитель поля зрения вставляют в окуляр (на металлический мостик), предварительно сняв верхнюю линзу окуляра. Вновь навинтив верхнюю линзу, вставляют окуляр в тубус микроскопа. С ограничителем поля зрения насчитывают в среднем 50 эритроцитов в каждом поле зрения микроскопа. Пользуясь иммерсионной системой, одновременно в мазке подсчитывают эритроциты и тромбоциты. Подсчет тромбоцитов заканчивают, насчитав 1000 эритроцитов. По ходу подсчета результаты записывают на бумаге. Затем в камере Горяева подсчитывают количество эритроцитов в 1 мм3 крови. Зная количество эритроцитов в 1 мм3 и количество тромбоцитов на 1000 эритроцитов, производят расчет.

Пример расчета. На 1000 эритроцитов подсчитано 70 тромбоцитов. Количество эритроцитов в 1 мм3 крови (подсчитаны в камере Горяева) составляет 4 200 000. Количество тромбоцитов в 1 мм3 равно:
70x4200000/1000 = 294 000.

Практически количество подсчитанных тромбоцитов умножают на первые четыре цифры числа эритроцитов, подсчитанных в камере Горяева. Норма тромбоцитов при подсчете по этому методу 200 000-400 000 в 1 мм3.

Подсчет тромбоцитов в счетной камере

Подсчет тромбоцитов в счетной камере производят следующим образом. Кровь набирают в смеситель для эритроцитов до метки 0,5, а раствор кокаина - до метки 101 и оставляют на 30 минут. Меланжер встряхивают, выпускают первые две капли, а третью каплю вносят в камеру Горяева, которую помещают на 5 минут во влажную камеру. Подсчет тромбоцитов производят так же, как и подсчет эритроцитов. Поэтому к подсчитанному количеству тромбоцитов приписывают четыре нуля. Подсчет можно производить как при обычном освещении микроскопа, так и с помощью фазовоконтрастного устройства. В камере Горяева тромбоциты имеют вид блестящих округлых образований, в несколько раз меньших, чем эритроциты. Этот метод отличается точностью и быстротой.

Норма тромбоцитов при подсчете по этому методу 150000-250000 в 1 мм3 крови.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ТРОМБОЦИТОВ В КРОВИ

Микроскопический метод подсчета

Чаще всего используется метод подсчета тромбоцитов в счетной камере Горяева микроскопией при фазовом контрасте, т.е. с фазово-контрастной приставкой. Мало точен и не может быть рекомендован метод подсчета тромбоцитов в мазке крови.

В настоящее время все шире используются определение количества тромбоцитов и их распределение по величине (гистограмма) с помощью автоматических счетчиков крови. Эти аппараты точны и позволяют проводить экспресс-диагностику (определения выполняются за 1 мин).

Принцип. Производится подсчет тромбоцитов в камере Горяева с применением в качестве разводящей и гемолизирующей жидкости раствора оксалата аммония. При подсчете используют фазово-контрастную микроскопию.

Реактивы. 1% раствор оксалата аммония.

Ход определения. Исследование можно проводить как в крови, полученной из пальца, так и в стабилизированной цитратом венозной крови. В последнем случае полученный при подсчете результат умножают на коэффициент 1,1 (учитывают разведение венозной крови раствором цитрата натрия - 9:1).

Разведение крови. Самым удобным и достаточно точным является способ разведения крови в пробирках (не в меланжере). Для этого, в предварительно высушенную чистую силиконированную или пластиковую (полистирол) пробирку пипеткой отмеривают 1,98 мл 1% оксалата аммония и осторожно вносят в нее 0,02 мл крови. В течение 1-2 мин содержимое пробирки тщательно перемешивают без вспенивания. Заполняют две камеры Горяева и на 10-15 мин помещают их для оседания тромбоцитов во влажную камеру (чашку Петри со смоченной фильтровальной бумагой или марлей). В каждой камере подсчитывают тромбоциты в 25 больших квадратах.

Фазово-контрастная микроскопия проводится при помощи обычного микроскопа, осветителя типа ОИ-19 (или аналогичного) и устройства для наблюдения методом фазового контраста КФ-1 или КФ-4.

Подготовка микроскопа. После установки на микроскопе фазовых объективов и фазового конденсора производят фокусировку объективов 40х на сетке камеры Горяева. Устанавливают освещение и центрируют изображение фазовой пластинки и кольцевой диафрагмы. Микроскопию проводят с зеленым светофильтром. При работе с фазово-контрастной установкой необходимо пользоваться камерами одного типа, так как фокусировка оптических систем зависит от толщины стекла камеры.

Расчет определения числа тромбоцитов в 1 мкл крови. Среднюю арифметическую величину из двух параллельных определений умножают на 1000 (площадь 25 больших квадратов - 1 мм 2 , высота камеры - 0,1 мм, разведение 1:100; следовательно, количество тромбоцитов должно быть умножено на1 х10х100 = 1000).

Нормальные пределы колебаний числа тромбоцитов в крови у человека составляют от 170 до 350 х 10 9 /л. Ошибка метода ± 6,5%.

Подсчет тромбоцитов в крови и определение их размера в мазке - важная часть диагностики тромбоцитопений, эссенциальной и полицитемической тромбоцитемии, ДВС-синдрома, тромботической тромбоцитопенической пурпуры и других микротромбоваскулитов, нарушений гемостаза при аутоимунных формах патологии (СКВ, антифосфолипидном синдроме и др.) и при гепатолиенальном синдроме. При наследственных тромбоцитопатиях наблюдаются формы с микроцитозом (синдром Вискотта-Олдрича) и преобладанием гигантских форм кровяных пластинок (аномалии Бернара-Сулье и Мей-Хегглина), а также формы без изменения размеров этих клеточных элементов.

Подсчет тромбоцитов на гематологическом анализаторе .

На сегодняшний день методом выбора при исследовании тромбоцитов является их определение на автоматическом анализаторе. Автоматические счетчики позволяют получать достаточно надежные результаты при определении количества тромбоцитов.

При подсчете тромбоцитов по Фонио коэффициент вариации находится в пределах 20%, в камере Горяева - составляет 7-10%, тогда как автоматический подсчет воспроизводится с точностью до 2-4%.

Современные анализаторы сигнализируют о выходе количества тромбоцитов за референтные пределы, наличии агрегатов тромбоцитов, макротромбоцитов или других элементов, сравнимых по объему с тромбоцитами (микроэритроциты), что существенно облегчает трактовку получаемых результатов.

В то же время следует иметь в виду, что в отличие от ручного подсчета тромбоцитов, где проводится предварительный лизис эритроцитов, автоматические счетчики крови анализируют тромбоциты и эритроциты в одной камере без предварительной обработки. Тромбоциты распознаются по размерам в диапазоне 2-20 фл. Это создает проблему дифференцирования больших форм тромбоцитов (макротромбоцитов) и сравнимых с ними по объему эритроцитов (микроцитов), их фрагментов (шизоцитов), а также отшнуровавшихся фрагментов цитоплазмы лейкоцитов (клеточный дебрис).

Ложное занижение числа тромбоцитов может быть при их агрегации, агглютинации под действием тромбоцитарных агглютининов и при прилипании тромбоцитов к лейкоцитам (тромбоцитарный «сателлитизм»). При подсчете на гематологических анализаторах в качестве антикоагулянта используется ЭДТА. При наличии аутоантител к тромбоцитам калиевая соль ЭДТА инициирует агрегацию тромбоцитов, что проявляется псевдотромбоцитопенией.

Нормальные величины. Количество тромбоцитов у здоровых людей составляет 170 - 350 х 10 9 /л.

Клиническое значение

Снижение количества PLT в крови - тромбоцитопения - может развиваться в результате снижения продукции PLT:

наследственные: синдром Франкони (Фанкони), врожденная тромбоцитопения, краснуха новорожденных;

приобретенные: лейкозы, миелодиспластические синдромы, миелофиброз, метастазы новообразований в костный мозг; дефицит витамина В12 и фолиевои кислоты (мегалобластные анемии), ночная пароксизмальная гемоглобинурия, вирусные инфекции, интоксикации, наследственные аномалии, ионизирующее облучение, прием миелодепрессивных препаратов, циклическая тромбоцитопения, почечная недостаточность. в результате повышения деструкции PUT: инфекции (значительное, иногда катастрофическое снижение PLT, наблюдается при Конго-Крымской геморрагической лихорадке), эклампсия беременных, гемолитико-уремический синдром (ГУС), ВИЧ-инфекция, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, системная красная волчанка, хронический лимфолейкоз, хронический активный гепатит, посттрансфузионная тромбоцитопения; гемодиализ, кровотечения, разрушение в селезенке (гиперспленизм при болезнях накопления, лимфомах, волосатоклеточном лейкозе, миелопролиферативных заболеваниях, портальной гипертензии);

в результате потребления PLT: синдром ДВС.

Клинико-диагностическое значение тромбоцитопений (по С.А. Луговской и соавт., 2002)

Патогенетические механизмы	Клинические ситуациии патологические состояния
Недостаточность гемопоэза -нарушение образования тромбоцитов	Гипо-и апластические состояния, лейкозы, метастазы рака в костный мозг, ионизирующее облучение, химиотерапия, дефицит витамина В12 или фолиевои кислоты, вирусные инфекции, сепсис, милиарный туберкулез и др.
Повышенное потребление тромбоцитов	Кровопотеря, ДВС, гигантская гемангиома, тромбоз, геморрагическая тромбоцитемия.
Повышенная деструкция тромбоцитов (внутриклеточный, внутрисосудистый гемолиз)	Ауто- и иммунные гемолитические анемии, изоиммунные, гетероиммунные (гаптеновые), лекарственные, вирусные, системная красная волчанка, лимфопролиферативные заболевания, поеттрансфузионные реакции и др.
Механические повреждения тромбоцитов	Протезирование клапанов сердца, экстракорпоральное кровообращение.
Интоксикация: экзогенная, эндогенная	Химические вещества, лекарственные препараты, алкоголь, уремия, тяжелые заболевания печени.
Повышенная секвестрация в селезенке (гиперспленизм)	Спленомегалия при циррозе печени, портальной гипертензии, гистиоцитозах, болезнях накопления, болезни Гоше, синдроме Фелти, туберкулезе селезенки, миелопролиферативных заболеваниях, талассемии.

Иммунные тромбоцитопении

(по С.А. Луговской и соавт., 2002)

Заболевание	Характеристика антитромбоцитарных антител
Идиопатическая (аутоиммунная) тромбоцитарная пурпура	Аутоантитела против неизмененных антигенов тромбоцитов больного
Гаптеновая (гетероимунная) тромбоцитопения	Гаптеновые аутоантитела против измененных или чужеродных антигенов на поверхности тромбоцитов
Лекарственная тромбоцитопения	Антитела против комплекса лекарства (хинин, гепарин) с тромбоцитарным антигеном
Тромбоцитопения, ассоциированная с вирусной инфекцией	Антитела против вирусных антигенов, фиксированных на поверхности тромбоцитов, или против измененных тромбоцитарных антигенов
Аллоиммунная тромбоцитопения	Аллоантитела против аллоантигенов тромбоцитов плода или переливаемых тромбоцитов
Неонатальная аллоиммунная тромбоцитопеническая пурпура	Аллоантитела матери, проникшие в организм плода. Направлены против аллоантигенов тромбоцитов плода и отца, отсутствующих на тромбоцитах матери

Повышение количества PLT в крови - тромбоцитоз - характерно для миелопролиферативных заболеваний. Тромбоцитоз наблюдается также при злокачественных новообразованиях, после операций, при воспалительных заболеваниях (острый ревматизм, ревматоидный артрит, туберкулез, остеомиелит), после спленэктомии, циррозе печени, кровотечениях, в период выздоровления при мегалобластных анемиях, лечении кортикостероидами, остром гемолизе, физических перенапряжениях.

Тромбоцитозы

Тромбоцитоз	Заболевания и синдромы
Реактивный	Спленэктомия, острая кровопотеря, острый гемолиз, состояние после операции, злокачественные новообразования, ревматоидный артрит, туберкулез, язвенный колит, остеомиелит
Опухолевый	Миелопролиферативные заболевания (хронический миелолейкоз, идиопатический миелофиброз, эритремия, хронический мегакариоцитарный лейкоз), острый мегакариобластный лейкоз, идиопатическая геморрагическая тромбоцитемия

Средний объем тромбоцита (МРV)

У здоровых людей MPV равен 6-12 фл и находится в обратной зависимости от числа тромбоцитов. MPV увеличивается с возрастом. У мужчин MPV несколько выше, чем у женщин.

Использование ЭДТА в качестве антикоагулянта вызывает изменение формы тромбоцитов от диска к сфере, что приводит к увеличению MPV на 10-12% в течение 2 часов, а затем показатель существенно не меняется. Под действием цитрата натрия MPV может уменьшаться или увеличиваться, а при высокой концентрации (1:4) - не изменяется со временем. Кроме типа применяемого антикоагулянта и времени от момента взятия пробы до исследования, на MPV оказывает влияние температура окружающей среды. Преходящее увеличение MPV отмечается у рабочих, контактирующих с асфальтовыми испарениями, органическими растворителями. MPV - важный диагностический показатель функции тромбоцитов.

PDW - показатель, являющийся мерой гетерогенности размеров (анизоцитоза) тромбоцитов. Величина PDW в среднем составляет 10-15%.

Как артефакт, ложно завышенное увеличение PDW может быть связано с присутствием микроцитов, шизоцитов, микроагрегатов тромбоцитов, фрагментов цитоплазмы лейкоцитов.

Этот показатель находится в обратной зависимости от числа тромбоцитов и их периода жизни. В каждом конкретном случае важна не только величина PDW, но и ее динамика во времени, а также связь с другими тромбоцитарными показателями. Так, увеличение PDW с одновременным снижением MPV свидетельствует о преобладании микротромбоцитов среди общей популяции тромбоцитов (указывает на угнетение тромбоцитопоэза), а сочетание повышенного PDW с увеличением MPV отражает нарастание числа макротромбоцитов (усиление продукции тромбоцитов). Одновременное присутствие фракций макротромбоцитов и микротромбоцитов ведет к увеличению PDW, но MPV может оставаться в пределах нормы. В современных гематологических анализаторах отдельными показателями указывается процентное содержание микротромбоцитов (MicroPLT) и макротромбоцитов (MacroPLT).

PDW может применяться для дифференциальной диагностики. Так, увеличение PDW свыше 15% было обнаружено у 50% больных эссенциальной тромбоцитемией, у 21% пациентов с реактивным тромбоцитозом и лишь у 14% здоровых людей.

РСТ - показатель, характеризующий процент тромбоцитарной массы в объеме крови: вычисляется суммированием прямо измеренных объемов тромбоцитов или произведением среднего объема тромбоцитов на их число.

У здорового человека показатель стремится остаться стабильным: при уменьшении числа тромбоцитов усиливается тромбопоэз, в циркулирующую кровь выбрасывается большее число молодых макротромбоцитов, что ведет к увеличению MPV. При увеличении количества циркулирующих тромбоцитов снижается продукция их в костном мозге, тем самым уменьшается процент макротромбоцитов и MPV уменьшается. Однако при нарушении этого равновесия происходит или уменьшение РСТ, что, в конечном счете, приводит к патологии первичного гемостаза и риску возникновения кровотечений, или повышение РСТ, увеличивающее активность тромбоцитов и их способность к агрегации. Это повышает риск тромбозов.

Нормальные значения РСТ варьируют в пределах 0,15-0,35%. Было обнаружено, что снижение РСТ менее 0,1% обусловило возникновение послеоперационных кровотечений у пациентов с развившейся тромбоцитопенией. Также было отмечено, что этот показатель оказался более чувствительным для оценки риска возникновения кровотечения, чем число тромбоцитов.

Если скрининговые методы указывают на нарушение функции тромбоцитов, необходимо выполнить специальные тесты с учетом диеты и лекарственных препаратов, принимаемых пациентом (отмена за 7-10 суток перед исследованием глюкокортикостероидов, аспирина и других нестероидных противовоспалительных средств, адреноблокаторов, блокаторов кальциевых каналов, антиагрегантов: пентоксифиллина, папаверина, теофиллина, дипиридамола, тиклопидина, антибиотиков - пенициллина, карбенициллина).

Методы определения длительности кровотечения

Длительность кровотечения является скрининговым тестом для выявления нарушений первичного гемостаза. Метод основан на определении времени кровотечения из нанесенной на поверхности кожных покровов небольшой ранки стандартного размера. Это время зависит от способности сосудисто-тромбоцитарных гемостатических механизмов останавливать кровотечение из поврежденных мелких сосудов и капиллляров и поэтому его продолжительность может характеризовать состояние первичного гемостаза. Оно может быть нарушено вследствие дефектов сосудистого звена, неполноценности функциональных свойств кровяных пластинок или дефицита/дефекта плазменных кофакторов тромбоцитарных реакций (фибриногена, фактора Виллебранда), выраженной тромбоцитопении. При снижении числа тромбоцитов менее 100x109/л имеется прямая связь между степенью тромбоцитопении и удлинением времени кровотечения. Длительность кровотечения коррелирует также с геморрагическими тенденциями при тромбоцитопатиях и болезни Виллебранда. Увеличение времени кровотечения наблюдается и при тяжелой анемии (Ht

Помимо решения диагностических задач тест рекомендуется проводить для контроля за эффективностью применяемой гемостатической терапии, для своевременного выявления угрозы геморрагических осложнений при проведении дезагрегационной терапии. Длительность кровотечения должна быть определена у больного в период предоперационной подготовки, т.к. значительная часть больных с патологией тромбоцитарного звена гемостаза имеет скрытую форму заболевания, которая тем не менее дает тяжелые кровотечения в ходе операции и после нее.

В настоящее время используют в основном два принципа при определении длительности кровотечения; проведение теста в условиях, не затрудняющих течение первичного гемостаза, и в условиях, препятствующих его осуществлению.

К первым методам относится тест Duke , при выполнении которого колотую ранку глубиной 3,5 мм наносят скарификатором в нижней части мочки уха; выступающие капли крови осторожно, не прикасаясь к раневой поверхности, снимают фильтровальной бумагой через 15-30 с. Регистрируют время от момента нанесения укола до прекращения кровотечения, которое в норме не превышает 4 мин. Тест малочувствителен и не позволяет выявить нарушения при тромбоцитопатиях легкой и средней тяжести.

Наиболее распространенными за рубежом методами определения длительности кровотечения второй группы являются различные модификации метода Ivy, который предложил проводить исследование на верхней конечности в условиях веностаза, затрудняющего сосудистые реакции.

Определение длительно сти кровотечения по методу Айви

Принцип метода

Оценивают длительность кровотечения после разреза кожи предплечья скарификатором с глубиной разреза 3 мм. Стандартизация метода достигается равной глубиной кожного разреза и созданием венозного стаза путем повышения венозного давления до 40 мм рт. ст. при помощи сфигмома-нометра, что предупреждает эффект преждевременного склеивания краев раны.

Реактивы и оборудование

70% раствор этанола.

Сфигмоманометр.

Скарификатор, способный осуществить разрез кожи глубиной 2-3 мм.

Ход выполнения

Сфигмоманометр накладывают на плечо, нагнетают в нем давление, равное 40 мм рт. ст., и поддерживают такое давление в течение всего исследования.

Ладонную поверхность предплечья обрабатывают раствором этанола.

Натягивают кожу предплечья в поперечном (по отношению к костям предплечья) направлении.

Скарификатором наносят три разреза кожи по 5-10 мм (направление разреза должно быть перпендикулярно натяжению кожи предплечья, т. е. параллельно костям предплечья) глубиной 3 мм и включают секундомер.

Капли крови осторожно удаляют фильтровальной бумагой путем ее смачивания через каждые 15-30 с.

Регистрируют время остановки кровотечения из каждой ранки.

Снижают давление в манжете сфигмоманометра.

Вычисляют средний результат длительности кровотечения для каждого из трех разрезов.

Существует несколько схожих методов для оценки длительности кровотечения , однако метод Айви отличается от аналогичных неплохой воспроизводимостью и малой травматичностью. В оригинальном исполнении нормальное время кровотечения не превышает 8 мин, однако указанный норматив условен, поскольку результаты определения длительности кровотечения этим методом значимо варьируют в зависимости от варианта скарификатора и опыта исследователя, поэтому необходимо уточнить нормативы для каждой лаборатории. При тромбоцитопениях, тромбоцитопатиях и болезни Виллебранда длительность кровотечения часто удлинена, а при изолированных дефектах коагуляцион-ного гемостаза (гемофилии и др.) длительность кровотечения не отличается от нормы.

Причины ошибок

Нестандартный скарификатор, неглубокий (менее 3 мм) разрез кожи, недостаточная квалификация лаборанта.

Исследование агрегационной функции тромбоцитов

Принцип метода

Тромбоциты способны агрегировать под воздействием различных субстанций, называемых индукторами (стимуляторами) агрегации (АДФ, адреналин, арахидоновая кислота, тромбин, кальциевый ионофор А23187, коллаген, фибрин-мономер, бычий коагуляционный фактор VIII, ристоцетин и др.). Изучение агрегационной функции тромбоцитов осуществляют при помощи специального прибора - агрегометра. В основе записи агре-гатограммы этим прибором - принцип Борна, который предполагает графическую регистрацию выраженности уменьшения оптической плотности богатой тромбоцитами плазмы в процессе агрегации тромбоцитов. В случае нарушения агрегационной функции тромбоцитов происходит незначительное изменение оптической плотности, что и регистрирует этот прибор.

Забор крови и подготовка плазмы для исследования

После пункции локтевой вены самотеком кровью наполняют пластиковую или силиконированную пробирку, в которую предварительно добавлен раствор цитрата натрия (соотношение объемов крови и цитрата натрия равно 9:1). Затем пробирку тщательно и аккуратно (без встряхивания) перемешивают в течение 2-3 минут.

Материалом для исследования является бедная тромбоцитами плазма.

БТП получают в два этапа. На первом этапе получают богатую тромбоцитами плазму, для чего цитратную кровь центрифугируют в течение 7 минут при 240 g. На втором этапе богатую тромбоцитами плазму переносят в другую пробирку и повторно центрифугируют в течение 15 минут при 1200-1400 g.

Реактивы и оборудование

0,11 М раствор цитрата натрия (Na3C6H607).

Агрегометр с компьютером и принтером.

Стимуляторы агрегации (АДФ, адреналин, коллаген и др.). В табл. 12 представлены оптимальные конечные концентрации наиболее распространенных стимуляторов агрегации тромбоцитов.

Таблица. Оптимальные конечные концентрации стимуляторов агрегации тромбоцитов

Индукторы тромбоцитарной агрегации	Конечные концентрации индукторов

Адреналин
Коллаген
Арахидоновая кислота
Ристоцетин	1,25-1,50 mg/ml
Ристоцетин для диагностики 2В типа болезни Виллебранда

Для проведения анализа предварительно необходимо подсчитать число тромбоцитов на гематологическом анализаторе или микроскопическим методом.

Ход определения

Материалом для исследования является богатая тромбоцитами плазма, но для калибровки прибора необходима еще и бедная тромбоцитами плазма.

Поскольку при разном числе тромбоцитов необходимы разные концентрации индукторов агрегации, следует приготовить богатую плазму с одинаковым числом тромбоцитов для всех образцов (исследуемых и контрольных). Для стандартизации числа тромбоцитов следует развести богатую тромбоцитами плазму бедной таким образом, чтобы число тромбоцитов стало равным 150-300 х 10 9 . Например, число тромбоцитов 600 х 10 9 , поэтому исследуемую богатую тромбоцитами плазму необходимо развести бедной тромбоцитами плазмой этого же больного в 2 раза. Таким образом, на первом этапе исследования очень важно определить число тромбоцитов.

Для записи агрегатограммы любому агрегометру необходимо определить оптическую плотность и ряд других параметров в исследуемых образцах, поэтому компьютерный алгоритм агрегометра будет требовать установить в измерительные гнезда пробирки с бедной и богатой тромбоцитами плазмами.

В кювету агрегометра вносят 0,3 мл богатой тромбоцитами плазмы (со стандартным числом тромбоцитов 150-300 х 10 9), инкубируют пробирку в гнезде для измерения в течение 60-120 с для нагрева богатой тромбоцитами плазмы до 37 °С, затем включают магнитную мешалку, добавляют 0,015 мл раствора индуктора агрегации. В момент добавления индуктора агрегации включают запись регистрации агрегации*.

Оценка результатов исследования

Существует много способов оценки агрегатограмм, но наиболее информативно измерение степени агрегации и угла наклона, поскольку неплохую воспроизводимость демонстрируют именно эти показатели. Их нормальный диапазон зависит от большого числа причин (марки агрегометра, используемых реагентов, числа тромбоцитов, конечной концентрации индуктора, скорости вращения магнитной мешалки и многих других), поэтому общепринятых диапазонов нормы при измерении агрегационной функции тромбоцитов нет. Это вынуждает врачей-лаборантов уточнять нормативы самостоятельно.

Применение низких концентраций стимуляторов агрегации дает возможность оценить раздельно первую и вторую волны агрегации. Большую ценность имеет информация о наличии или отсутствии второй волны агрегации, поскольку именно вторая волна на агрегатограмме отражает реакцию высвобождения содержимого тромбоцитарных гранул (плотных и а-гранул). Весьма полезно при записи агрегации тромбоцитов использовать несколько стимуляторов агрегации. При наличии геморрагического синдрома и отсутствии нарушений агрегации тромбоцитов необходимо повторно выполнить исследование через 1-1,5 месяца. И наоборот, при наличии специфичных изменений агрегации для болезни Бернара-Сулье, тромбастении Гланцманна и другой патологии необходимо повторно исследовать агрегационную функцию тромбоцитов.

Причины ошибок

Тест очень чувствителен к дефектам преаналитического этапа. Даже минимальный недостаток цитрата натрия вследствие низкого гематокрита ведет к значительным погрешностям и невоспроизводимым результатам.

Последовательность манипуляций и объемы смешиваемых реагентов могут отличаться для разных типов агрегометров.

Для исследования агрегации необходимо использовать специальные иглы для пункции кубитальной вены, которые способны наполнить кровью пробирки с цитратом натрия самотеком. Забирать кровь шприцом нельзя.

Некачественная обработка магнитных мешалок и пробирок ведет к грубым ошибкам. Существенную помощь в обработке лабораторной посуды оказывают ультразвуковые мойки.

Неточный замер прибором оптической плотности богатой и бедной тромбоцитами плазмы также приводит к ошибкам. Подобный дефект возможен при наличии царапин на пробирках.

Неточное определение числа тромбоцитов и, как следствие, исследование образца плазмы с нестандартным числом тромбоцитов является причиной ошибок.

Варианты результатов записи агрегации тромбоцитов методом Борна при различных вариантах нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза.

Патология гемостаза		Арахи-доновая кислота	Коллаген	Адреналин	Ристоцетин
Тромбоцитопатия	Норма или снижение*	Норма или снижение*	Норма или снижение*	Норма или снижение*
Влияние аспирина или других нестероидных противовоспалительных препаратов		Отсутствие или значимое снижение	Норма для концентрации 5 ug/ml или снижение для концентрации 2 ug/ml	Снижение с нарушением формирования второй волны на агрегато-	Норма или умеренное снижение
Нарушение пула хранения	Норма или снижение (часто умеренное) с нарушением второй волны			Снижение с нарушением формирования второй волны на агрегато-грамме
Синдром Бернара-Сулье					Отсутствие или значимое снижение
Нарушение реакций высвобождения (секреции) из тромбоцитарных гранул	Норма или снижение (часто умеренное) с нарушением второй волны			Снижение с нарушением формирования второй волны на агрегато-
Тромбастения Гланцманна	Отсутствие	Отсутствие	Отсутствие	Отсутствие
Болезнь Виллебранда					Отсутствие или значимое снижение (иногда норма при 2N, повышение при типе 2В)

При тромбоцитопатиях может быть нарушена агрегация с одним (обуславливая так называемую парциальную тромбоцитопатию) или разными индукторами агрегации.

Иногда диагностические трудности возникают при дифференциальной диагностике болезни Виллебранда и болезни Бернара-Сулье, поскольку варианты нарушений при исследовании агрегационной функции тромбоцитов при этих состояниях одинаковы. В этом случае помогает добавление в исследуемую богатую тромбоцитами плазму нормальной БТП или крио-преципитата. Эта простая модификация восстанавливает ристомициновую агрегацию у больных с болезнью Виллебранда, но не исправляет нарушение агрегации при болезни Бернара-Сулье.