Immunoblotanalüüs (immunoblot, Western blot, Western blot)- kombineerib ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) viiruse antigeenide eelneva elektroforeetilise ülekandega nitrotselluloosribale (ribale).

Selles ilusas teaduslikus nimes tõlgitakse "blot" tõenäoliselt kui "blot" ja "western" - kui "lääne" peegeldab selle "bloti" leviku suunda paberil vasakult paremale, see tähendab geograafilisel kaardil vastab see suunale läänest itta. Immuunblot-meetodi olemus seisneb selles, et immunoensüümi reaktsioon viiakse läbi mitte antigeenide seguga, vaid HIV-antigeenidega, mis on eelnevalt immunoforeesi teel jaotatud fraktsioonideks, mis paiknevad molekulmassi järgi nitrotselluloosmembraani pinnal. Selle tulemusena jaotuvad peamised HIV-valgud, antigeensete determinantide kandjad, pinnale eraldi triipudena, mis ilmuvad ensüümiga seotud immunosorbendi reaktsiooni käigus.

Immunoblot sisaldab mitut etappi:

Riba ettevalmistamine. Immuunpuudulikkuse viirus (HIV), mis on eelnevalt puhastatud ja hävitatud selle koostisosadeks, allutatakse elektroforeesile ning HIV-i moodustavad antigeenid eraldatakse molekulmassi järgi. Seejärel kantakse blot-meetodil (analoogselt üleliigse tindi blotterile väljapressimisega) antigeenid nitrotselluloosi ribale, mis sisaldab nüüd HIV-le iseloomulike antigeeniribade spektrit, mis on endiselt silmale nähtamatu.

Näidisuuring. Uuritav materjal (patsiendi seerum, vereplasma jne) kantakse nitrotselluloosi ribale ja kui proovis on spetsiifilisi antikehi, seonduvad need rangelt vastavate (komplementaarsete) antigeensete ribadega. Järgnevate manipulatsioonide tulemusena selle interaktsiooni tulemus visualiseeritakse – tehakse nähtavaks.

Tulemuse tõlgendamine. Ribade olemasolu nitrotselluloosplaadi teatud piirkondades kinnitab rangelt määratletud HIV antigeenide vastaste antikehade olemasolu testitud seerumis.

Riba A – positiivne kontroll

Riba B – nõrk positiivne kontroll

Rada C – negatiivne kontroll

Rada D – positiivne proov (tuvastatud HIV-1 antikehad)

Praegu on immunoblotanalüüs (immunoblot) peamine meetod viirusspetsiifiliste antikehade olemasolu kinnitamiseks uuritavas seerumis. Mõnel HIV-nakkuse korral tuvastatakse spetsiifilised antikehad enne serokonversiooni toimumist tõhusamalt immunoblotanalüüsiga kui ELISA-ga. Immunoblotanalüüsi meetodil uurides selgus, et kõige sagedamini avastatakse gp 41 vastaseid antikehi AIDS-i haigete seerumis ning ennetuslikel eesmärkidel uuritud inimestel p24 tuvastamine nõuab täiendavaid uuringuid, et teha kindlaks, kas neil on HIV-nakkus. Immunoblotanalüüsi testimissüsteemid, mis põhinevad geneetiliselt muundatud rekombinantsetel valkudel, on osutunud spetsiifilisemaks kui tavalised puhastatud viiruslüsaadil põhinevad süsteemid. Rekombinantse antigeeni kasutamisel ei moodustu mitte difuusne, vaid selgelt piiritletud kitsas antigeeniriba, mis on salvestamiseks ja hindamiseks kergesti ligipääsetav.

HIV-1-ga nakatunud isikute seerumitest ilmnevad antikehad järgmiste peamiste valkude ja glükoproteiinide vastu - struktuursed ümbrise valgud (env) - gp160, gp120, gp41; tuum (gag) - p17, p24, p55, samuti viiruse ensüümid (pol) - p31, p51, p66. Env-vastased antikehad on tüüpilised HIV-2 jaoks - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol - lk 68.

Reaktsiooni spetsiifilisuse kindlakstegemiseks vajalike laboratoorsete meetodite hulgas on enim tunnustatud HIV-1 ümbrisvalkude - gp41, gp120, gp160 ja HIV-2 - gp36, gp105, gp140 vastaste antikehade tuvastamine.

WHO loeb positiivseteks seerumiteks, milles tuvastatakse immunoblotimise teel antikehad mis tahes kahe HIV glükoproteiini vastu. Nende soovituste kohaselt, kui reaktsioon tekib ainult ühe ümbrisvalguga (gp 160, gp 120, gp 41) kombinatsioonis või ilma reaktsioonita teiste valkudega, peetakse tulemust kahtlaseks ja soovitatakse uuesti testida, kasutades komplekt mõnest teisest seeriast või mõnest teisest ettevõttest. Kui ka pärast seda jääb tulemus kahtlane, on soovitatav jälgida 6 kuud (uuring 3 kuu pärast).

Positiivse reaktsiooni olemasolu p24 antigeeniga võib viidata serokonversiooni perioodile, kuna selle valgu vastased antikehad ilmuvad mõnikord esimesena. Sel juhul soovitatakse olenevalt kliinilistest ja epidemioloogilistest andmetest uuringut korrata seerumiprooviga, mis on võetud vähemalt 2 nädalat hiljem ja just seda juhul, kui HIV-nakkuse korral on vajalik paariseerumite testimine.

Positiivsed reaktsioonid gag- ja pol-valkudega, ilma reaktsioonita env-valkudega, võivad peegeldada varajast serokonversiooni ja samuti viidata HIV-2 infektsioonile või mittespetsiifilisele reaktsioonile. Isikuid, kellel on need tulemused pärast HIV-2 testimist, testitakse uuesti 3 kuu pärast (6 kuu jooksul).

Kirjeldus

Määramise meetod Immunoblot.

Uuritav materjal Vere seerum

Võimalik kodukülastus

Antinukleaarsed antikehad on autoantikehade perekond, mis seondub ribonukleiinhapete ja nendega seotud valkudega. Neid esineb rohkem kui 90% -l difuusse sidekoehaigusega patsientidest ning sageli täheldatakse neid ka autoimmuunsete maksahaiguste ja mitmete muude seisundite korral. Praeguseks on selle autoantikehade perekonna iseloomustatud umbes 200 sorti, kuid kõiki neist ei saa kliinilises praktikas kasutada.

Tuumavastaste antikehade immunoblot võimaldab ühe testiga üheaegselt uurida 15 põhitüüpi antinukleaarseid antikehi, mis tagab peamiste süsteemsete reumaatiliste haiguste diferentsiaaldiagnoosi. Iga immunobloti abil tuvastatud autoantikeha tüüpi täheldatakse tavaliselt iseloomuliku kliinilise pildiga patsientidel, seega võimaldab autoantikehade spekter mitte ainult haigust diagnoosida, vaid määrata ka teatud kliiniliste ilmingute tekkimise riski.

Seroloogilise uuringu teises etapis on soovitatav kasutada antinukleaarsete antikehade immunoblotti, kui teiste testide tulemus on positiivne, mis viitab tuumavastaste antikehade olemasolule patsiendi seerumis. Sellised testid hõlmavad antinukleaarsete antikehade määramist (ELISA sõeluuring), tuumavastase faktori (ANF) tuvastamist Hep2 rakkudel (), tuumavastaste antikehade ja ekstraheeritava tuumaantigeeni (ENA) vastaste antikehade määramist.

Tuumavastaste antikehade immunoblotanalüüsi meetodit süsteemsete reumaatiliste haiguste diagnoosimisel iseloomustab kõrge kliiniline spetsiifilisus. Kuid tuumavastaste antikehade spetsiifilisust, isegi kõrge ANF-i () tiitrite korral, ei saa alati kindlaks teha, kuna mitmed tuumavastased antikehade antigeenid jäävad endiselt iseloomustamata. Negatiivne immunobloti tulemus ei välista sel juhul süsteemsete reumaatiliste haiguste diagnoosimist. Immunobloti - müosiidispetsiifiliste autoantikehade paneeli () ja immunobloti - sklerodermia (sklerodermia) autoantikehade paneeli abil saab tuvastada mitmeid antinukleaarseid antikehi.

Kirjandus

1. Lapin S.V. Totolyan A.A. Autoimmuunhaiguste immunoloogiline laboratoorne diagnostika / Kirjastus "Man", Peterburi - 2010. 272 ​​lk.
2. Nasonov E.L., Aleksandrova E.N. Reumaatiliste haiguste laboratoorse diagnostika kaasaegsed standardid. Kliinilised soovitused / BHM, M - 2006.
3. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantikehad organspetsiifilistes autoimmuunhaigustes: diagnostiline viide/ PABST, Dresden – 2011. 300 lk.
4. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantibodies in Systemic Autoimmune Diseases: A Diagnostic Reference/ PABST, Dresden – 2007. 300 lk.
5. Gershvin ME, Meroni PL, Shoenfeld Y. Autoantibodies 2nd ed./ Elsevier Science – 2006. 862 lk.
6. Shoenfeld Y., Cervera R, Gershvin ME Diagnostic Criteria in Autoimmune Diseases / Humana Press – 2008. 598 lk.
7. Reaktiivikomplekti juhised.

Ettevalmistus

Eelistatav on oodata 4 tundi pärast viimast söögikorda, kohustuslikud nõuded puuduvad.

Näidustused kasutamiseks

Uuring on näidustatud järgmiste seisundite diagnoosimiseks ja diferentsiaaldiagnoosimiseks:

• süsteemne erütematoosluupus;
• alaäge nahaluupus ja muud tüüpi nahaluupus;
• segatud sidekoehaigus;
• Sjögreni sündroom ja sellega seotud haigused;
• difuusne ja lokaalne skleroderma, CREST sündroom;
• põletikulised müopaatiad (polümüosiit ja dermatomüosiit);
• juveniilne krooniline artriit;
• autoimmuunne hepatiit;
• primaarne biliaarne tsirroos ja skleroseeriv kolangiit;
• selle testi kasutamine on näidustatud, kui tuvastatakse kõrge antinukleaarse faktori, antinukleaarsete antikehade, ekstraheeritava tuumaantigeeni vastaste antikehade, DNA-vastaste antikehade, nukleosoomivastaste antikehade ja fosfolipiid-antikehade tiitrid.

Tulemuste tõlgendamine

Uurimistulemuste tõlgendamine sisaldab teavet raviarsti jaoks ega ole diagnoos. Selles jaotises olevat teavet ei tohiks kasutada enesediagnostikaks ega eneseraviks. Täpse diagnoosi paneb arst, kasutades nii selle uuringu tulemusi kui ka muudest allikatest saadavat vajalikku infot: haiguslugu, teiste uuringute tulemusi jne.

Mõõtühikud: kvalitatiivne test, tulemus esitatakse kujul "tuvastatud" või "ei tuvastatud".

Kui tuvastatakse mis tahes tüüpi antikeha olemasolu iseloomustav riba, kirjeldatakse riba värvi intensiivsust lisaks plusside (“ristide”) arvuga iga tuvastatud antikehatüübi puhul. Positiivsuse astme suurenemine peegeldab kaudselt autoantikehade sisaldust ja afiinsust.

Võrdlusväärtused: Sm, RNP/Sm, SS-A (60 kDa), SS-A (52 kDa), SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENP-B, dsDNA, histooni, nukleosoomi antikehad , Rib P, AMA-M2, Jo-1 ei tuvastatud.

Autoantikehade määramise tulemus on esitatud iga vastava antigeeni "ristidena". Seropositiivsuse astme suurenemine peegeldab kaudselt autoantikehade sisaldust ja afiinsust. Seropositiivsuse hindamise tulemuse valikud on toodud allpool:

1. Antikehi ei tuvastatud.
2. +/- - piiripealne tulemus;
3. + – spetsiifilise antigeeni vastaste autoantikehade vähene sisaldus;
4. ++ – autoantikehade keskmine sisaldus konkreetse antigeeni suhtes;
5. +++ – kõrge autoantikehade sisaldus konkreetsele antigeenile.

Peamised tuumavastaste antikehade tuvastamisega seotud haigused:

Antigeen	Tähendus
Sm (Smith)	Süsteemse erütematoosluupuse spetsiifiline marker (sisaldub American College of Rheumatology, ACR SLE 10. kriteeriumis)
SS-A (Ro52)	Seda täheldatakse mitmesuguste autoimmuunhaiguste, sagedamini süsteemse erütematoosluupuse ja selle nahavormide, süsteemsete reumaatiliste haiguste, reumatoidartriidi, autoimmuunsete maksahaiguste jne korral.
SS-A (Ro60)	Süsteemne erütematoosluupus, erütematoosluupuse nahavormid, valgustundlikkus süsteemse erütematoosluupuse korral, suur risk kaasasündinud erütematoosluupuse ja loote südamekahjustuse tekkeks. Sjögreni sündroomi peamine seroloogiline näitaja. Märgitakse sageli koos SS-A (Ro52) antigeeni vastaste antikehadega.
SS-B	Sjögreni sündroom, süsteemne erütematoosluupus.
PCNA	Süsteemne erütematoosluupus, luupusnefriidi oht.
Ribosoomid (RiboP)	Süsteemne erütematoosluupus, kesknärvisüsteemi kahjustuse oht.
Nukleosoomid	Süsteemne erütematoosluupus, suur luupusglomerulonefriidi risk.
Kaheahelaline DNA	Süsteemse erütematoosluupuse spetsiifiline marker (sisaldub SLE 10. ACR-kriteeriumis), kõrge risk nefriidi luupuse tekkeks.
snRNP/Sm	Sidekoe segahaigus, madala neerukahjustuse riskiga süsteemne erütematoosluupus, sklerodermia.
Histoonid	Süsteemne erütematoosluupus, ravimitest põhjustatud luupus, sklerodermia.
Scl-70	Süsteemne skleroos koos naha ja siseorganite difuusse kahjustusega.
PM-Scl	Sklerodermia, millega kaasneb polümüosiit.
CENP-B	CREST sündroom koos sklerodaktüüliaga, telangiektaasia, nahaalused lupjumised, Raynaud' sündroom, ösofagiit.
Jo-1	Polümüosiit antisüntetaasi sündroomi kujul.
AMA-M2	Primaarne biliaarne tsirroos, Sjögreni sündroom.

immunoblotanalüüs -(inglise keelest "blot" - spot) - meetod antigeenide (või antikehade) tuvastamiseks tuntud seerumite (või antigeenide) abil. See on geelelektroforeesi ja ELISA kombinatsioon. Esialgu hävitatakse ultraheli abil bakterirakud või virioonid, seejärel eraldatakse elektroforeesiga kõik viiruse või bakterirakkude antigeenid ning saadakse kaubanduslik reagent spetsiaalsel nitrotsellulooskilel. Immunoblotanalüüsi tegemisel kantakse uuritava patsiendi seerum teadaolevate antigeenidega kilele. Pärast inkubeerimist ja seondumata antikehade pesemist jätkake ELISA-ga – kilele kantakse ensüümiga märgistatud inimese immunoglobuliinide antiseerum ja kromogeenne substraat, mis muudab ensüümiga suhtlemisel värvi. Immunoglobuliini-ensüümi komplekside antigeen-antikeha-antiseerumi juuresolekul tekivad kandjale värvilised laigud. Immunoblotanalüüs võimaldab eraldi tuvastada erinevate patogeeni antigeenide vastaseid antikehi (näiteks HIV-nakkuse korral tuvastab immunoblotanalüüs gp120, gp24 ja teiste viirusantigeenide vastaseid antikehi).

Radioimmunoanalüüs (RIA)

Meetod põhineb antigeen-antikeha reaktsioonil, kasutades radionukliidiga märgistatud antigeeni või antikeha. Märgistustena kasutatakse 125I, 14C, 3H, 51Cr ja teisi radionukliide. Saadud immuunkompleksid eraldatakse süsteemist ja nende radioaktiivsus määratakse loenduritel (β-kiirgus). Kiirguse intensiivsus on otseselt võrdeline seotud antigeeni ja antikeha molekulide arvuga.

RIA tahkefaasiline versioon, mis kasutab märgistatud antikehi või polüstüreenpaneelide aukudesse sorbeeritud antigeene, on laialt levinud.

RIA-d kasutatakse mikroobide, viiruste, erinevate hormoonide, ensüümide, ravimite, immunoglobuliinide, aga ka teiste uuritavas materjalis sisalduvate ainete tuvastamiseks väiksemates kontsentratsioonides 10-12-10-15 g/l.

Kontrollküsimused

Immuunse bakteriolüüsi reaktsioon: milline reaktsioon see on; mis on antigeen, mis on antikeha, reaktsioonimehhanism, tootmismeetodid, praktiline rakendus. Immuunse hemolüüsi reaktsioon: vajalikud koostisosad, protseduur; juhtnupud, praktiline rakendamine. Lokaalne hemolüüsi reaktsioon geelis (Jerne'i reaktsioon): reaktsiooni põhimõte, koostise meetod, praktiline rakendus. Komplemendi fikseerimise reaktsioon: reaktsiooni põhimõte; mis tekib immuunseerumi interaktsioonil spetsiifilise antigeeniga; mis juhtub komplemendiga, kui see on selle interaktsiooni ajal olemas? Milline on komplemendi saatus, kui antigeeni ja antikehade vahel puudub spetsiifiline afiinsus? Millise reaktsiooni abil saab kindlaks teha, mis komplemendiga juhtus; miks seda konkreetset reaktsiooni kasutatakse; Mis on RSC nähtav positiivne tulemus? Miks? Millist komplemendi omadust kasutatakse RSC esimeses faasis? Teises etapis? Kui RSC lõpptulemus on hemolüüs, kas see tähendab positiivset või negatiivset tulemust? Selgitage tulemusi: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Nimetage esimese RSK süsteemi koostisosad ja teise RSK süsteemi koostisosad. Miks on vaja testitav seerum inaktiveerida? Kuidas komplementi tiitritakse? Hemolüütiline seerum: mida see sisaldab, kuidas seda saadakse, mis on tiiter ja kuidas seda määratakse? Milliseid loomi kasutatakse RSC komponentide saamiseks? RSC külmas seadistamise metoodika. Milline järgmistest reaktsioonidest nõuab komplemendi osalemist etapis: sadestumine, flokulatsioon, aglutinatsioon, mittetäielike antikehade tuvastamine, immuunbakteriolüüs, immuunhemolüüs, Jerne, RSC? Immunofluorestsentsreaktsioon (RIF) – näitab sündmuste jada otseses Koonsi reaktsioonis; vajalikke koostisosi. Mis on antigeen, mis on antikeha, millega antikehi märgistatakse, kuidas reaktsiooni tulemust arvestatakse, milline näeb välja positiivne tulemus? Praktiline rakendus – mida saab selle reaktsiooni abil kindlaks teha? Kaudne immunofluorestsentsreaktsioon - näidata sündmuste jada selle reaktsiooni käigus, vajalikud koostisosad, mis on antigeen, milliseid immuunseerumeid kasutatakse; praktiline kasutamine; kaudse RIF-i eelis võrreldes otsese reaktsiooniga. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) – reaktsioonipõhimõte; vajalikud koostisosad; näidata sündmuste jada, kui sooritate reaktsiooni antigeeni tuvastamiseks uuritavas materjalis; vajalikud koostisosad; Mis juhtub, kui tulemus on positiivne, kuidas see välja näeb? Märkige toimingute jada ELISA läbiviimisel antikehade tuvastamiseks uuritavas seerumis; vajalikud koostisosad; mis juhtub, kui tulemus on positiivne? Immunoblotanalüüs – reaktsiooniprintsiip; põhietapid; vajalikud koostisosad; kuidas tulemust arvestatakse; reaktsiooni eelised. Radioimmunoanalüüs (RIA) - millised on reaktsiooni peamised etapid; Millega märgistatakse antikehi või antigeene, kuidas tulemust arvesse võetakse? Immunoelektronmikroskoopia - meetodi põhimõte; põhietapid; vajalikud koostisosad; millega antikehad on märgistatud? kuidas reaktsiooni tulemust arvesse võetakse. Immobilisatsioonireaktsioonid – meetodi põhimõte, seadistustehnika, komponendid, tulemuste registreerimine.

Ülesanded, mis tuleb täita iseõppimise käigus.

Täitke tabel “Immuunreaktsioonid” seoses selle teema raames käsitletud reaktsioonidega.

Immuunsed reaktsioonid

Õpilastöö praktilise tunni ajal

Alustage tööd kohe RSK 1. faasi seadistamisega, kuid kirjutage see hiljem oma märkmikusse (vt allpool).

1. Immuunse hemolüüsi reaktsioon. Vaadake immuunhemolüüsi demonstratsioonireaktsiooni, visandage see diagrammi kujul, selgitage tulemust katse- ja kontrollkatsutis.

2. Komplemendi fikseerimise reaktsioon

a) sõeluda RSK-d vastavalt tabelile;

b) joonistage vihikusse tabeli kujul RSC seadistuse skeem;

c) pane RSK teine ​​faas (esimene faas pannakse tunni algusesse);

d) analüüsib RSC jaoks vajalikke diagnostilisi preparaate;

d) võtta arvesse tulemust. Sõnastage järeldus spetsiifiliste antikehade olemasolu kohta uuritavas seerumis.

3. Immunofluorestsentsreaktsioon. Uurige tabelit, koostage vihikusse reaktsiooni skeem; vaadake diagnostilisi seerumeid; määrata, mida seerum sisaldab, kuidas seda valmistatakse, milliseks reaktsiooniks (otsene või kaudne RIF) seda kasutatakse. Vaadake RIF-i demonstratsiooni tulemust fluorestsentsmikroskoobis.

4. Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA). Koostage oma märkmikus skeem reaktsiooni seadistamiseks kahes versioonis: antigeeni tuvastamiseks uuritavas materjalis ja antikehade tuvastamiseks seerumis. Vaadake üle HIV ja B-hepatiidi koostisosade komplekt. Tehke kindlaks, mida iga koostisosa sisaldab ja milleks seda kasutatakse.

5. Immunoblotanalüüs. Koostage oma märkmikusse reaktsiooni skeem; vaadake demonstratsiooni - reaktsiooni tulemus.

6. Radioimmunoanalüüs (RIA). Koostage oma märkmikusse reaktsiooni skeem.

7. Immuunelektronmikroskoopia (IEM). Vaadake demonstratsiooni - reaktsiooni tulemus, koostage märkmikusse reaktsiooni diagramm, märkige nooltega antigeen (viirus) ja märgistatud antikehad.

Immunoblotanalüüs on ülitundlik meetod valkude tuvastamiseks, mis põhineb elektroforeesi ja ELISA või RIA kombinatsioonil. Immunoblotimist kasutatakse HIV-nakkuse diagnostilise meetodina jne.

Üldises mõttes viitab immunoblotanalüüs valkude segu analüüsile, mis on kantud tahkele membraani kandjale, millega need on seotud kovalentsete sidemetega, millele järgneb immuuntuvastus.

Saate analüüsida otse substraadile kantud valkude segu - dot blot analüüsi - või pärast selle esialgset fraktsioneerimist elektrofokuseerimise, ketaselektroforeesi või kahemõõtmelise elektroforeesi abil - Western blot analüüsiga.

Patogeeni antigeenid eraldatakse polüakrüülamiidgeelelektroforeesi abil, seejärel kantakse need geelilt üle aktiveeritud paberile või nitrotselluloosmembraanile ja arendatakse ELISA abil.

Ettevõtted toodavad selliseid ribasid antigeenide "blotidega". Nendele ribadele kantakse patsiendi seerum. . Seejärel, pärast inkubeerimist, pestakse patsient seondumata antikehadest ja kantakse ensüümiga märgistatud inimese immunoglobuliinide vastane seerum. . Ribale moodustunud kompleks (antigeen + patsiendi antikeha + inimese Ig vastane antikeha) tuvastatakse kromogeense substraadi lisamisega, mis muudab värvi ensüümi toimel.

Seda metoodikat kasutatakse ka bakterite, faagide või viiruste kloonide selekteerimiseks, mis ekspresseerivad sihtmärkkloonitud geeniprodukte.

Valkude ülekandmine membraanile toimub kas passiivselt või kasutades elektrotransferseadmeid. Valgu membraanile ülekandmise efektiivsust mõjutavad paljud tegurid, nagu valkude molekulmass, geeli poorsus, ülekandeaeg ja kasutatava puhverlahuse (trans-puhvri) koostis.

Sõltuvalt katse eesmärkidest ja tingimustest valitakse ülekandetingimused, mis annavad parima tulemuse. Substraatidena kasutatakse tavaliselt nitrotselluloosi, polüvinülideendifluoriidi (PVDF) või positiivselt laetud nailonmembraane. Nitrotselluloos suudab siduda kuni 80 - 100 μg valku 1 cm2 kohta.

Pesemise tulemusena võivad kaduda madala molekulmassiga valgud (molekulmassiga alla 20 kDa), mis võimaldab eelnevalt uurida teatud geneetiliste lookuste polümorfismi vastavate DNA restriktsioonifragmentide pikkuste põhjal.

Lisaks saate Southern hübridisatsiooni abil hõlpsalt teada saada, kas sihtgeeni siseosas on teatud restriktsiooniensüümi hüdrolüüsi koht, mis võimaldab teil valida uuritava genoomi piirkonna kloonimiseks optimaalse strateegia.

Sarnase skeemi abil saab RNA molekule agaroosigeelilt üle kanda nitrotselluloosfiltrisse. Seda meetodit nimetati Northern blottingiks, erinevalt Southern blotting'ist, kuna nimi Southern tähendab inglise keeles "lõunamaa".

Valkude ülekandmist geelist filtritele nimetati vastavalt Western blot analüüsiks. Naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) lahuses denatureeritud suured valgud (>100 kDa) võivad membraanile halvasti kanduda, kui transpuhvris on etanool. Alkohol parandab oluliselt valkude ülekandumist SDS-polüakrüülamiidgeelist, kuid ahendab geelis olevaid poore, mis viib suurte valkude säilimiseni.

PVDF-i membraan on optimeeritud immuuntuvastuseks ja on võimeline säilitama kuni 160 μg/cm2 spetsiifiliselt seotud valke väga madala mittespetsiifilise seondumise tasemega.

Immunoblotanalüüs

Selle membraani oluline omadus on selle korduva kasutamise võimalus. Zeta-Probe nailonmembraanid seovad tõhusalt SDS-valke ilma alkoholita ja see seondumine on järgnevate töötluste suhtes vastupidav. Tõhusalt säilivad ka madala molekulmassiga valgud. Zeta-Probe membraanid võimaldavad suure seondumisvõimega, ligikaudu 480 μg valku cm2 kohta, tuvastada katsesegudes valgu jälgi.

Kui antigeen on membraanile immobiliseeritud, blokeeritakse ülejäänud seondumiskohad želatiini, veise seerumi albumiini või kooritud piima lahustega.

Seejärel inkubeeritakse membraani uuritava antigeeni vastaste polüklonaalsete või monoklonaalsete antikehade lahuses. Pärast seondumata antikehade mahapesemist inkubeeritakse membraani sekundaarsete antikehade lahuses, mis on leeliselise fosfataasi (AP) või mädarõika peroksidaasi (HRP) ensüümide konjugaat liigivastaste antikehadega (küüliku, hiire või inimese immunoglobuliinide vastased kitse antikehad). ) või valgud A (Staphylococcus aureuse valk) või G (Streptococcus sp. valk), millel on kõrge afiinsus immunoglobuliinide Fc piirkonna suhtes.

Moodustunud immuunkomplekside tuvastamine toimub keemiliselt või kemoluminestseeruvalt. Aluselise fosfataasi konjugaatide kasutamisel on keemilise reaktsiooni substraatideks 5-bromo-4-kloro-3-indolüülfosfaat (BCIP) või sinine tetrasoolium (NBT) ning mädarõika peroksidaasi konjugaatide kasutamisel - 4-kloro-1-naftool ja vesinikperoksiid. .

Ensümaatiliste reaktsioonide tulemusena moodustub membraanile antigeen-antikeha kompleksi lokaliseerumiskohas värviline riba või laik.

Selle meetodi tundlikkus on 100 pg valku AP konjugaate ja 100-500 pg HRP konjugaate kasutades. Immuunkomplekside kemiluminestseeruv tuvastamine võimaldab tuvastada vähem kui 5 pg antigeeni. Selle meetodi põhimõte seisneb selles, et kui HRP reageerib vesinikperoksiidi ja tsüklilise diatsüülhüdrasiinluminooliga, kiirgatakse valgust lainepikkusel 428 nm, mida saab salvestada valgustundlikule filmile.

Immunoblotanalüüs (IB) töötati välja ELISA põhjal. See on kõige spetsiifilisem ja tundlikum immunokeemilise analüüsi meetod. Immunoblotanalüüs (inglise keelest blot - blot, stain) ühendab ELISA ja elektroforeesi. Seda kasutatakse mitte HIV-vastaste komplekssete antikehade, vaid selle üksikute struktuurvalkude (valgud p24, glükoproteiinid gp120, gp 41 jne) tuvastamiseks. Viitab ekspertide (kinnitavatele) reaktsioonidele HIV-nakkuse diagnoosimisel.

Reaktsioon viiakse läbi mitmes etapis:

Viirus hävitatakse komponentideks - antigeenideks (p24, gp120, gp 41 jne), mis allutatakse elektroforeesile polüakrüülamiidgeelis, see tähendab antigeenide eraldamist fraktsioonideks molekulmassi järgi.

2. Geel kaetakse nitrotselluloosmembraaniga ja antigeenifraktsioonid kantakse sellele elektroforeesi abil. Nitrotselluloos käitub nagu kuivatuspaber. Membraan lõigatakse ribadeks. Ettevõtted toodavad selliseid ribasid antigeenide "blotidega".

Immunoblotanalüüs - täiendav kaudne meetod

HIV-antigeenidega kaetud ribad kastetakse subjekti seerumis ja seejärel pestakse seondumata materjali eemaldamiseks.

4. Ribasid inkubeeritakse peroksidaasiga märgistatud antiglobuliini seerumiga ja pestakse.

Lisatakse substraat ja märgitakse AG-AT kompleksi lokalisatsioonitsoonile vastavate värviliste fraktsioonide (laikude) arv.

Ribade esinemine riba teatud piirkondades kinnitab rangelt määratletud HIV-antigeenide vastaste antikehade olemasolu testitud seerumis. Immunoblotanalüüsi tulemus loetakse positiivseks, kui membraanil on nähtavad triibud, mis vastavad mis tahes kahele kolmest HIV antigeenist - p24, gp41 ja gp 120 (joonis 37).

JOONISED

KASUTATUD VIIDATUTE LOETELU

Peamine kirjandus

Meditsiiniline mikrobioloogia, viroloogia ja immunoloogia: õpik arstitudengitele. ülikoolid 2. väljaanne, rev. ja täiendav — 702 lk. Ed. A.A. Vorobjova. M.: MIA, 2012.

2. Mikrobioloogia, viroloogia ja immunoloogia: juhend laboritundidele: õpik/(V.B. Sbojatšakov jt); toimetanud V. B. Sboychakova, M. M. Karapats. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 lk.: ill.

3. Meditsiiniline mikrobioloogia, immunoloogia ja viroloogia [Elektrooniline ressurss]: mee õpik.

ülikoolid - 760 p. — Juurdepääsurežiim: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. Peterburi: Spetslit, 2010.

4. Meditsiiniline mikrobioloogia, viroloogia ja immunoloogia [Elektrooniline allikas]: õpik: 2 köites / Vol. 1. - 448 lk. — Juurdepääsurežiim: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

M.: Geotar Media, 2010. .

5. Meditsiiniline mikrobioloogia, viroloogia ja immunoloogia [Elektrooniline allikas]: õpik: 2 köites T. 2. - 480 lk. Juurdepääsurežiim: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M.: Geotar Media, 2010.

lisakirjandust

1. Immunodiagnostilised reaktsioonid: õpik / koost: G.K.Davletšina, Z.G.Gabidullin, A.A.Akhtarijeva, M.M.Tuigunov, A.K.Bulgakov, T.A.Savtšenko, R.F.

Khusnarizanova, Yu.Z. Gabidullin, M.M. Alsynbaev - Ufa: Venemaa tervishoiuministeeriumi riigieelarvelise kutsekõrgkooli BSMU kirjastus, 2016. - 86 lk.

2. Mõnede omaduste tunnused, mis määravad bakterite Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus kaaskultiveeritud variatsioonide patogeense potentsiaali: teaduslik väljaanne / Yu. Z. Gabidullin, R. S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 s.

Avaleht » Immunoblot – mis see on? Immunoblot nakkushaiguste diagnoosimisel

Immunoblot - mis see on? Immunoblot nakkushaiguste diagnoosimisel

Mis on immunoblot? See on levinud meetod inimese viirusnakkuste laboratoorseks diagnoosimiseks. See on üks täpsemaid ja usaldusväärsemaid viise HIV-nakkuse tuvastamiseks.

Usaldusväärsuse huvides on see isegi suurem kui ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (elisa). Immunobloti tulemusi peetakse lõplikuks ja lõplikuks.Üldine teave

Immunoblot - mis see on? HIV-nakkuse tuvastamiseks peate läbima laborianalüüsi, et testida oma vereseerumist antikehade esinemise suhtes.

Western blot'i sektsioone nimetatakse ka Western blot'ideks. Seda kasutatakse täiendava ekspertmeetodina inimese viirusnakkuste tuvastamiseks. See on vajalik ELISA kinnitamiseks - laborianalüüs, mis võimaldab teil määrata HIV-i antikehade olemasolu veres. Immunoblot kontrollige uuesti positiivset ELISA-d.

Seda peetakse kõige tundlikumaks, keerukamaks ja kallimaks.

Sihtmärk

Mis on immunoblot? See meetod vereseerumi laboratoorseks testimiseks viirusevastaste antikehade tuvastamiseks.

Spetsiaalsete uuringute käigus leiti geelist ja nitrotselluloosmembraanidelt viiruse üldvalgud.

Immunoblotanalüüs (antikehade tuvastamine patsiendi seerumis teatud patogeeni antigeenide suhtes)

Western blot sektsiooni protseduur on ette nähtud HIV-nakkuse määramiseks erinevates etappides. Esimeses etapis allutatakse selle koostisosadest puhastatud viirusele elektroforees ja selles sisalduvad antigeenid jagatakse molekulmassi järgi.

Inimese immuunpuudulikkuse viirus paljuneb elusrakkudes, mis on sisestatud tema geneetilisse teabesse. Selles etapis saab inimene HI-viiruse kandjaks, kui olete nakatunud.

Selle haiguse eripära on see, et see ei avaldu pikka aega. Viirus hävitab lümfotsüüte, mistõttu inimese immuunsus langeb ja organism ei suuda infektsioonidega võidelda.

Kui HIV-i ravitakse õigesti ja kiiresti, elab patsient küpse vanaduseni. Ravi puudumine viib paratamatult surmani. Alates nakatumise hetkest, kuid ilma ravita, ei ole maksimaalne periood üle kümne aasta.

Iseärasused

Immunoblotanalüüs on usaldusväärne meetod, mis võimaldab teil määrata esimest ja teist tüüpi HIV-antigeenide vastaste antikehade olemasolu.

Kui inimene on nakatunud, võidakse kahe nädala pärast tuvastada antikehad palju hiljem. HIV-i eripära on see, et antikehade hulk suureneb kiiresti ja jääb patsiendi verre. Isegi kui need on olemas, ei pruugi haigus avalduda kahe või enama aasta jooksul. ELISA meetod ei näita alati täpselt haiguse esinemist, mistõttu on vaja kinnitada PCR-i ja Western blot sektsioonide tulemused, kui ensüümi immuunanalüüs näitas positiivset tulemust.

Näidustused

Milline “immunoblot” on juba välja selgitatud, kuid mida uuringus tutvustatakse?

Inimese immuunpuudulikkuse viiruse (HIV) testimise põhjus on positiivne ELISA tulemus. Patsientidel, kellel on ees operatsioon, on vaja läbida ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs. Lisaks peaksite analüüsima naisi, kes plaanivad rasedust, samuti neid, kes on lootusetud. HIV-nakkusega patsientidele määratakse Western blot lõigud, kui Elisa tulemused on kahemõttelised.

Arsti poole pöördumise põhjuseks võivad olla järgmised murettekitavad sümptomid: kiire kaalulangus; nõrkus, funktsioonikaotus; soolehäired (kõhulahtisus), mis kestavad kolm nädalat; dehüdratsioon; palavik; suurenenud lümfisõlmed kehas; kandidoosi, tuberkuloosi teke. , kopsupõletik, toksoplasmoos, herpese ägenemine.

Patsient ei pea enne veenivere loovutamist valmistuma.

Ärge sööge 8-10 tundi enne analüüsi. Päev enne vereloovutamist ei ole soovitatav juua alkoholi ega kohvijooke, teha rasket füüsilist koormust ega kogeda ärevust.

Kus analüüsi teha?

Kust saab HIV-testi teha?

ELISA, immunoblotanalüüs, mis tehakse linna erakliinikutes, annab tulemuse ühe päevaga. Võimalik on ka kiire diagnoos. Avalikes asutustes on Elisa ja Western blot sektsioonide meditsiinilised testid vastavalt Vene Föderatsiooni õigusaktidele tasuta.

Kohustuslik nakkushaiguste sõeluuring rasedatel ja haiglaravi või operatsiooni vajavatel patsientidel Kuidas seda testi tehakse?

Kuidas teha ELISA-d? Immunoblot positiivne/negatiivne kinnitab või lükkab ümber elisa tulemused. Protseduur on üsna lihtne. Spetsialist kogub venoosset verd, mis võtab aega vähem kui viis minutit.

Pärast proovi võtmist tuleb süstekoht desinfitseerida ja katta sidemega. Proovide võtmine toimub tühja kõhuga, nii et pärast protseduuri ei tee paha süüa tahvel tumedat šokolaadi või magusat kuuma jooki.

Saatekirja saamiseks riiklikus raviasutuses tasuta testile tuleb külastada terapeudi.

Üldiselt ei erine immunoblot kogumise järgi teistest vereanalüüsidest. Uurimismetoodika on lihtne. Kui inimese veres on viirus, hakkab organism selle hävitamiseks tootma antikehi. Iga viiruse jaoks on palju valgu antigeene. Nende antikehade tuvastamine on Western blot sektsiooni meetodi aluseks. Hind

Kui kaua analüüs kestab? HIV-immunoblot on üks odavamaid teste.

Keskmiselt on immuunanalüüsi sõelumismeetodid vahemikus 500 kuni 900 rubla. Western blot'i sektsioonid on testide uurimine, mille maksumus on vahemikus kolm kuni viis tuhat rubla. Keerulisemad meetodid on palju kallimad. Näiteks polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) analüüsi eest peate maksma umbes 12 000 rubla.

Tulemuste tõlgendamine

Kõige tavalisemad HIV-nakkuse diagnoosimise meetodid on ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs ja immunoblot.

Neid kasutatakse inimese immuunpuudulikkuse viiruse antikehade määramiseks seerumis. Nakatumist kinnitavad tavaliselt kaks testi: sõeluuring ja kinnitav. Tulemusi peab tõlgendama arst, kes paneb diagnoosi ja määrab ravi. Kui immunoblot on positiivne, tähendab see, et inimkehas on viirus.

Positiivne tulemus ei tohiks olla iseseisva ravi põhjuseks, kuna igal patsiendil võib haigusest olla oma pilt.

Kvalitatiivne analüüs hõlmab sõeluuringut ja sertifitseerimist. Kui patsiendil viirust ei tuvastata, on tulemus "negatiivne". Kui see sertifikaat avastatakse, viiakse läbi täiendavad sõeluuringud. Immunoblotanalüüs, mis kinnitab või lükkab ümber sõeluuringu. Kui testribad ilmuvad teatud tumedatesse kohtadesse (valkude lokaliseerimine), tehakse HIV-diagnoos.

Kui tulemused on kahtlased, tehakse testid kolme kuu jooksul.

Inimese immuunpuudulikkuse viirusega nakatumise vältimiseks on see võimalik, kui järgite teatud reegleid: vältige juhuslikku seksuaalset kontakti, kasutage kontakti ajal kondoome, ärge kasutage ravimeid.

Kui haigus avastatakse rasedal naisel, on oluline järgida raviarsti soovitusi ja ärge unustage testida viiruse olemasolu.

Mis on Western blotting?

Valkude tuvastamine mitmesuguste kudede keerukates segudes või ekstraktides on üks sageli esinevaid probleeme. Kasutades sellist vahendit nagu spetsiifilised antikehad, on võimalik määrata uuritav valk minimaalse aja- ja rahakuluga.

Western blot meetodi puhul eraldatakse valkude segu esimeses etapis naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) juuresolekul elektroforeesiga, seejärel kantakse elektroblotanalüüsiga nitrotselluloosmembraanile.

Selle meetodi olemus seisneb selles, et pärast elektroforeesi asetatakse geel filterpaberi kihtide vahele nitrotselluloosmembraanile. Sel viisil kokku pandud “võileib” asetatakse elektrivälja, nii et valgu-SDS kompleksid liiguvad üle geelplaadi ja immobiliseeritakse (mittespetsiifilise sorptsiooni tulemusena) nitrotselluloosmembraani pinnale.

Valk-SDS kompleksi seondumine nitrotselluloosmembraaniga hõlmab peamiselt elektrilisi jõude ja see interaktsioon on mitmepunktiline ja viib valkude "levitamiseni" membraani pinnal. Nii saame pärast elektroülekannet nitrotselluloosil geeli koopia, mille valgud paiknevad samamoodi nagu polüakrüülamiidgeelis.

Pärast SDS-i elektroforeesi, elektrotransferi ja valkude sorptsiooni geelist nitrotselluloosmembraanile muutub valgu tertsiaarne konformatsioon oluliselt, kui üldiselt on õige rääkida valgu tertsiaarse struktuuri olemasolust pärast sellist karmi töötlemist. Seetõttu kasutatakse uuritava valgu immunokeemiliseks tuvastamiseks tavaliselt ainult valgu molekuli lineaarsetele piirkondadele spetsiifilisi mono- või polüklonaalseid antikehi.

51. Ensüümide immunoanalüüs, immunoblotanalüüs. Mehhanism, komponendid, rakendus.

Konformatsiooniliste epitoopide (või allüksustevahelisi kontakte hõlmavate piirkondade) suhtes spetsiifilised antikehad ei sobi üldiselt Western blot analüüsis kasutamiseks.

Pärast valgu ülekandmist inkubeeritakse membraani järjestikku uuritava valgu suhtes spetsiifiliste antikehadega ja seejärel primaarsete antikehade Fc-fragmentide suhtes spetsiifiliste sekundaarsete antikehadega, mis on konjugeeritud ensüümi (või mõne muu) märgisega (joonis fig.

1 A). Juhul, kui uuritava antigeeni suhtes spetsiifilised primaarsed antikehad on otseselt konjugeeritud märgisega, ei ole sekundaarsed antikehad vajalikud (joonis 1 B). Uuritava valgu lokaliseerimise kohas moodustunud immuunkompleksid "avaldatakse" kromogeense substraadi abil (olenevalt märgistuse tüübist).

Meetodi tundlikkus ja spetsiifilisus sõltuvad suuresti sellest, milliseid antikehi uurimistöös kasutatakse.

Kasutatavad antikehad peavad olema spetsiifilised ainult uuritavale valgule iseloomuliku ainulaadse aminohappejärjestuse suhtes. Vastasel juhul on võimalik antikehade interaktsioon (eriti toorvalgu ekstraktide puhul) mitme valgu molekuliga, mis omakorda toob kaasa mitmete värviliste ribade ilmumise membraanile.

Sel juhul on uuritava valgu tuvastamine sageli keeruline või isegi võimatu.

Teine oluline tegur, mida antikehade valimisel silmas pidada, on afiinsus. Mida kõrgem on kasutatavate antikehade afiinsus, seda heledamad ja selgemad valguribad värvuvad, seda suurem on meetodi tundlikkus. Kõrge afiinsusega antikehade kasutamisel on võimalik saavutada tundlikkus 1 ng või isegi suurem.

Membraaniga seotud antigeeni ja antikehade vahelise interaktsiooni tulemuse visualiseerimiseks kasutatakse sekundaarseid antikehi, mis on konjugeeritud ainetega, mis on võimelised teatud tingimustel teatud signaali tootma.

Tavaliselt kasutatakse sellise ainena ensüümi (peroksidaas või fosfataas), mille reaktsiooniprodukt on värviline ja sadestub membraanile lahustumatu sademena.

Selle meetodi puhul on võimalik kasutada ka fluorestseeruvaid märgiseid.

Riis. 1. Uuritava valgu immunokeemilise värvimise skeem: A - ensüümmärgisega konjugeeritud sekundaarsete antikehade kasutamine; B – primaarne antikeha on otseselt konjugeeritud ensüümi märgisega.

Protokoll:

I. Geeli ja membraani valmistamine ning valgu elektrotransfer

Pärast elektroforeesi asetatakse polüakrüülamiidgeel blotpuhvriga (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glütsiin, 10% etanool) vanni.

Kaks lehte filterpaberit, mis on lõigatud bloteerimiskasseti kuju järgi ja niisutatud bloteerimispuhvriga, asetatakse kasseti anoodi poole jäävale osale. Seejärel asetatakse filterpaberile sama puhvriga eelnevalt niisutatud nitrotselluloosmembraan, jälgides, et membraani ja paberi vahele ei jääks õhumulle.

Seejärel tuleb geel ettevaatlikult membraanile asetada, pöörates erilist tähelepanu sellele, et geeli ja membraani vahele ei jääks õhumulle. Võileiva moodustamise lõpetavad kaks kihti niisutatud filterpaberit, mis asetatakse geeli pinnale (joonis 2). Saadud võileib kinnitatakse kassetti ja asetatakse elektroodide vahele nii, et membraan on anoodi poole.

Riis. 2. Valkude elektriülekande skeem membraanile.

II. Elektriline ülekanne

Valkude elektrotransfer nitrotselluloosmembraanile viiakse läbi puhvris, mis sisaldab 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glütsiini, 10% etanooli 30-50 minuti jooksul konstantsel pingel 100 V.

Elektriülekande aeg sõltub ülekantavate valkude suurusest; mida suurem on valk, seda kauem kulub elektriülekanne. Elektrotransfer kvaliteeti ja valguribade asukohta hinnatakse nitrotselluloosmembraani värvimisega Ponceau S 0,3% lahusega 1% äädikhappes. Enne immunokeemilist värvimist tuleb membraani mitu korda pesta nõrgalt leeliselise Tris-i vesilahusega, et eemaldada valkudega seotud värvaine.

III. Nitrotselluloosmembraanile immobiliseeritud valkude immunokeemiline värvimine

Mittespetsiifiliste antikehade seondumiskohtade blokeerimiseks inkubeeritakse membraani pidevalt segades toatemperatuuril 30 minutit PBST-s (parema blokeerimise jaoks võib kasutada 10% lõssipulbrit sisaldavat PBST lahust).

Pärast blokeerimist inkubeeritakse membraani tund aega toatemperatuuril pidevalt segades PBST-s, mis sisaldab 1-10 μg/ml spetsiifilisi antikehi.

Antikehade optimaalne kontsentratsioon valitakse empiiriliselt ja see sõltub antikehade interaktsiooni afiinsusest antigeeniga.

Inkubeerimise lõpus peske membraani 5 korda PBST-ga ja viige see mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud sekundaarsete antikehade lahusesse. Konjugaadi lahjenduse märgib tavaliselt pakendil tootja või valib selle empiiriliselt uurija. Inkubeerige membraani sekundaarse antikeha lahuses 1 tund pidevalt segades.

Pärast põhjalikku pesemist (vahetage puhvrit vähemalt 5-6 korda) viiakse PBST membraan kromogeensele substraadi lahusele, mis sisaldab 3 mg diaminobensidiini (DAB) ja 10 μl 30% vesinikperoksiidi 10 ml 0,1 M Tris-HCl-s. , pH 7,6.

Inkubeerimine viiakse läbi segades 5-10 minutit. Pärast substraadiga inkubeerimise lõpetamist tuleb membraani pesta PBST-ga, kuivatada filterpaberiga blotimisega ja teha koheselt värvilise skaneerimisega elektrooniline koopia. Kui membraan kuivab täielikult, tuhmuvad maalitud valgutriibud ning pilt muutub vähem eredaks ja kontrastseks.

Märkus: DAB on mürgine ja potentsiaalne kantserogeen. Töötage ainult kummikinnastega!

Immunoblotanalüüs (immunoblot) on ülispetsiifiline ja ülitundlik referentsmeetod, mis kinnitab diagnoosi patsientidele, kellel on saadud positiivsed või ebamäärased testitulemused, sh. kasutades RIGA või ELISA. Immunoblotanalüüs on heterogeense immuunanalüüsi tüüp.

See patogeeni üksikute antigeenide antikehade tuvastamise meetod põhineb ELISA läbiviimisel nitrotselluloosmembraanidel, millele kantakse spetsiifilised valgud eraldi ribadena, mis eraldatakse geelelektroforeesiga. Kui teatud antigeenide vastased antikehad on olemas, ilmub riba vastavasse lookusesse tume joon. Immunobloti unikaalsus seisneb selle kõrges teabesisalduses ja saadud tulemuste usaldusväärsuses.

Uuringu materjaliks on inimese seerum või plasma. Ühe riba uurimiseks on vaja 1,5-2 ml verd või 15-25 µl seerumit.

Laboratory Diagnostics LLC kasutab EUROIMMUNi (Saksamaa), MIKROGENi (Saksamaa) erinevate haiguste patogeenide antikehade tuvastamiseks immunoblotanalüüsi komplekte:

HSV 1 ja HSV 2 IgM/IgG(herpesviiruse infektsioon)

CMV IgM/IgG(tsütomegaloviiruse infektsioon)

Punetiste IgG

TORCH IgM profiil(toksoplasmoos, punetised, tsütomegaloviirus, HSV 1 ja HSV 2)

EBV IgMTIgG(Epsteini-Barri viirusinfektsioon)

HCV IgG(viiruslik C-hepatiit)

Kasutatakse kahte tüüpi komplekte - Western blot ja line blot.

Western blot: Komplektid sisaldavad testmembraani ribasid, millel on elektroforeetiliselt eraldatud vastavate nakkusetekitajate natiivsed antigeenid, st. antigeenid on järjestatud molekulmassi järgi. Membraanidele võib kanda ka 1-2 täiendavat joont kliiniliselt oluliste antigeenidega (Western line blot). See on usaldusväärne kinnitusmeetod, mis välistab valepositiivsed vastused ja ristreaktsioonid.

Line blot: Sel juhul kantakse testriba membraanidele kindlas järjekorras ainult kliiniliselt olulisi antigeene (natiivseid, sünteetilisi või rekombinantseid). Seda lähenemisviisi kasutatakse mitme infektsiooni diferentsiaaldiagnostikas ühel ribal.

Selle olemus seisneb uuritava aine molekulide ülekandmises ühelt biopolümeeride fraktsioneerimiseks kasutatavalt tahkelt kandjalt teisele, kus need identifitseeritakse spetsiifiliselt immunokeemilise reaktsiooni abil. Kaasaegne ülitundlik meetod seisneb valkude, sealhulgas viirusantigeenide tuvastamises. Meetod põhineb geelelektroforeesi ja antigeen-antikeha reaktsiooni kombinatsioonil. Kõrge eraldusvõime saavutatakse valkude, glüko- ja lipoproteiinide elektroforeetilise eraldamise ning immuunseerumite või monoklonaalsete antikehade tuvastamise maksimaalse spetsiifilisusega. Optimaalsetes tingimustes võib immunoblotanalüüs tuvastada antigeeni koguses, mis on väiksem kui 1 ng testitavas mahus. Tehniliselt viiakse immunoblotanalüüs läbi kolmes etapis:

1) analüüsitavad valgud eraldatakse polüakrüülamiidgeelis denatureerivate ainete juuresolekul: naatriumdodetsüülsulfaat või uurea, seda protsessi nimetatakse sageli SDS-PAGE-ks; eraldatud valke saab pärast värvimist visualiseerida ja võrrelda võrdlusproovidega;

2) eraldatud valgud kantakse geelist ülekattega (blotimisega) peale
nitrotselluloosfilter ja sellele kinnitatud; paljudel juhtudel, kuid
Valkude kvantitatiivsed suhted ei säili ülekande ajal alati;

3) filtritele paigaldatakse polü- või monoklonaalsed detektorid
radioisotoopi või ensüümi märgist sisaldavad antikehad; Sest
seotud antikehade tuvastamiseks kasutatakse ka liigivastast analüüsi
märgistatud seerum, teisisõnu blotimise viimases etapis
sarnased tahke faasi immuunanalüüsidega.

Tuleb meeles pidada, et selle immunoblotanalüüsi korral on valgud denatureeritud ja seetõttu ei pruugi natiivse valgu suhtes spetsiifilised antikehad neid ära tunda, kuid kõigi peptiidide koostises olevate seerumite juuresolekul võib kogu peptiidi antigeenne spekter. testitav valk tuvastatakse samaaegselt. Immunoblotimist kasutatakse üsna laialdaselt hepatiidiviiruste struktuuri uuringutes, eelkõige üksikute tüvede vahelise antigeense seose kindlakstegemiseks. Immunoblotanalüüsi kõrge eraldusvõime võimaldab saada häid tulemusi diagnostilises praktikas, kui on vaja tuvastada viirust patsiendi kudedes või väljaheidetes.

Sõltuvalt uuritavast ainest eristatakse DNA-d, RNA-d ja valku – blotanalüüs.

Antigeenide immunokeemilist tuvastamist saab läbi viia, kasutades märgisega konjugeeritud antikehi. Viimasel ajal on märgistusena laialdaselt kasutatud kas radioaktiivseid isotoope või ensüüme (peroksidaas, aluseline fosfataas, laktamaas jne).

Blotimise aeg difusiooni teel on 36-48 tundi.Kuid kiireim ja efektiivseim viis valkude ülekandmiseks geelidest on elektroblotanalüüs, mis võtab tavaliselt aega 1-3 tundi, mõne kõrgmolekulaarse valgu puhul kulub üle 12 tunni.

Sorbentide spetsiifiline valik blotide erinevate modifikatsioonide jaoks (nitrotselluloos või vastavalt töödeldud paber), blokeerimistingimuste valik ja antigeenide immunokeemiline tuvastamine sõltub täielikult antigeenist, selle kogusest, immuunanalüüsi meetodist ja uuringu eesmärkidest.

Võime tuvastada patogeeni spetsiifiliste antigeenide vastaseid antikehi võimaldab hinnata nende antikehade olulisust (spetsiifilisus antud etioloogilise aine suhtes) ja välistada reaktsiooni ristantigeenidele. See eristab immunoblotimist ELISA-st, kus antigeenina saab kasutada erinevaid antigeensete determinantide kombinatsioone – nii spetsiifilisi kui ka mitte, andes ristreaktsioonid teiste patogeenidega. Teisel juhul, kui ELISA-s saadakse positiivne tulemus, võib ainult eeldada, et see on ristreaktsiooni tagajärg, kuid immunoblotanalüüsi puhul on see otsustav.

Mitmel põhjusel on infoturbe meetod enim levinud kinnitustestina kasutamiseks sobiva meetodina.

Meetodi vaieldamatu eelis on võimalus testida nõrgalt või täielikult lahustumatute antigeenide antikehi ja kõrvaldada radioaktiivse märgise antigeenidesse viimise etapp.

Tundlikkust IB puhul hinnatakse geelile kantud maksimaalse antigeeni koguse järgi, mida saab valgu fraktsioneerimisel pärast geelist tahkesse faasi (nitrotselluloosi) viimist immunokeemiliselt tuvastada. Analüüsi üldine tundlikkus sõltub mitmest tegurist: antigeeni fraktsioneerimise ja immobiliseerimise tingimustest tahkel kandjal, taustatasemest, antikehade spetsiifilisusest ja afiinsusest. Oluline on kasutatava sildi tüüp ja selle tuvastamise meetod.

Seega võimaldab immunoblotanalüüs määrata antigeeni tsoone tahkel faasil, sidumata kogu valku spetsiifiliste seerumi antikehadega. Immunoblotimist ja selle modifikatsioone kasutatakse peamiselt bakterite ja viiruste antigeenide ja antikehade tüpiseerimiseks, eriti tavasüsteemide ebapiisava lahutusvõime korral, samuti immunoglobuliinide, nukleiinhapete analüüsimisel või kinnitustestina kombinatsioonis teiste meetoditega.

Ristlõike tulemuste tõlgendamine reaktsioonides ja serokonversiooni algfaasis on suuri raskusi. Esimeses olukorras ei tuvastata teatud aja möödudes korduva uuringu käigus antikehi, kuid teises immunoblotis tekivad uued ribad, mis näitavad HIV valkude või glükoproteiinide vastaste antikehade ilmnemist, iseloomustavad immuunreaktsiooni vastuse dünaamikat. viiruse antigeenid.

See on tegelikult seroloogiliste uuringute ahela lõplik kontrollimeetod, mis võimaldab teha lõpliku järelduse patsiendi HIV-positiivsuse kohta või selle tagasi lükata. IB teostamiseks kasutatakse nitrotselluloosi ribasid, millele kantakse eelnevalt molekulmasside suurendamise järjekorras horisontaalse ja seejärel vertikaalse immunoforeesi teel HIV valgud. Testitud seerumites olevad antikehad interakteeruvad valkudega riba teatud piirkondades. Reaktsiooni edasine kulg ei erine ELISA omast, st see hõlmab riba töötlemist konjugaadi ja kromogeen-substraadiga, sidumata komponentide mahapesemist ja reaktsiooni peatamist destilleeritud veega. Valkude esialgne elektroforeetiline eraldamine ja nende fikseerimine nitrotselluloosile võimaldab tuvastada spetsiifiliste valkude vastaseid antikehi vastavalt riba vastavate tsoonide värvumise (hallikassinise) olemasolule (või puudumisele). Immunoblotimist ei saa kasutada masssõeluuringuks selle kõrge hinna tõttu ja see on individuaalse arbitraaži meetod seroloogilise uuringu viimases etapis.

Seerumi testimise IB ja ELISA tulemuste vahel on üsna selge seos. ELISA-s (erinevates testisüsteemides) kaks korda positiivsed seerumid tõlgendatakse seejärel IB-s HIV-positiivsena 97–98% juhtudest. Seerumid, mis on ELISA-s positiivsed ainult ühes kahest kasutatud testisüsteemist, osutuvad IB-s HIV-positiivseteks mitte sagedamini kui 4% juhtudest. Kinnitusuuringute läbiviimisel võib umbes 5% IB-st anda nn "määramata" tulemusi, mis reeglina vastavad positiivsele ELISA-le, kuid mitte RIP-le. Ligikaudu 20% juhtudest on "määratlemata" IB-d põhjustatud HIV-1 gag-valkude vastastest antikehadest (p55, p25, p18). Kui saadakse küsitavad immunoblotanalüüsi tulemused, tuleb uuringut korrata 3 kuu pärast ja kui tulemus jääb ebaselgeks, siis 6 kuu pärast.

Radioimmunoanalüüs (RIM) (Radioimmunoassay, RIA) Radioimmunoanalüüs on meetod bioloogiliselt aktiivsete ainete (hormoonid, ensüümid, ravimid jne) kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes vedelikes, mis põhineb soovitud stabiilsete ja sarnaste radionukliididega märgistatud ainete konkureerival sidumisel spetsiifiliste sidumissüsteemidega. Viimased on enamasti spetsiifilised antikehad. Tänu sellele, et märgistatud antigeeni lisatakse kindlas koguses, on võimalik määrata, milline osa ainest on antikehadega seotud ja see osa, mis jääb tuvastatud märgistamata antigeeniga konkureerimise tulemusena sidumata. Uuring viiakse läbi in vitro. R. a. toota standardseid reaktiivide komplekte, millest igaüks on ette nähtud ühe aine kontsentratsiooni määramiseks. Uuring viiakse läbi mitmes etapis: bioloogiline materjal segatakse reagentidega, segu inkubeeritakse mitu tundi, eraldatakse vabad ja seotud radioaktiivsed ained, tehakse proovi radiomeetria ja arvutatakse tulemused. Meetod on ülitundlik, seda saab kasutada südame-veresoonkonna, endokriinsete ja muude süsteemide haiguste diagnoosimisel, viljatuse põhjuste, loote arenguhäirete väljaselgitamisel, onkoloogias kasvajamarkerite määramisel ja ravi efektiivsuse jälgimisel, immunoglobuliinide, ensüümide ja raviainete kontsentratsioon. Mõningatel juhtudel tehakse uuringuid stressifunktsionaalsete testide taustal (näiteks insuliinitaseme määramine vereseerumis glükoositaluvuse testi taustal) või dünaamikas (näiteks suguhormoonide määramine veres menstruaaltsükkel).

Kasutades ABBOTT - Austria II-I 125 kaubanduslikku komplekti, on võimalik tuvastada HBsAg kontsentratsioonides kuni 0,1 ng/ml. Meetodi eelisteks on võimalus standardiseerida ja automatiseerida meetodit digitaalsete vastuste saamisega. Meetodi puuduseks on radioaktiivse materjaliga töörežiimist tulenevad piirangud ja diagnostikakomplekti suhteliselt lühike säilivusaeg, mis on seotud radioaktiivse märgise lagunemisega.

Izotop (Taškent) ja mõned välismaised ettevõtted (näiteks ABBOTT) toodavad diagnostikakomplekte A-, B- ja D-hepatiidi viiruste erinevate antigeenide ja nende vastaste antikehade tuvastamiseks. Tahke faasina kasutatakse polüstüreenkuule (EBBOTT) või katseklaase (isotoop). Antikehade või antigeenide märgistamiseks kasutatakse kõige sagedamini isotoopi I 125, mille poolestusaeg on 60 päeva ja kõrge spetsiifiline radioaktiivsus. Radioaktiivse märgistusaine ehk kiirguse mõõtmine toimub spetsiaalsetel loenduritel - raadiospektromeetritel. Radioaktiivsete impulsside loendamine nii kontroll- kui ka uuritavates proovides viiakse läbi ühel kindlal ajal, tavaliselt 1 minuti jooksul. Reaktsioonitulemuste analüüsimisel tuleb arvestada taustradioaktiivsuse olemasoluga, mis võib mõjutada reaktsiooni lõpptulemust. Suurenenud fooni põhjused võivad olla: proovinõu või pesa saastumine; seadme valed sätted; tugeva kiirgusallika olemasolu seadme läheduses.

Proovide esmasel sõelumisel saadud positiivse tulemuse kinnitamiseks on soovitatav korrata testimist RIA-ga või alternatiivse testiga. Kui HBsAg tuvastatakse, tuleb teha kinnitustest.

Tabel 1. Vaktsiinide klassifikatsioon

Bibliograafia:

Kohustuslik:

1. Khaitov R.M., Ignatieva G.A., Sidorovitš I.G. Immunoloogia: Õpik.-M.: Meditsiin, 2000.- 432 lk.: ill (Õpik meditsiiniülikoolide üliõpilastele).

2. Kovaltšuk L.V. jt Immunoloogia: töötuba: õpik. käsiraamat – M.: GEOTAR-Media, 2012. – 176 lk.

3. Pozdejev O.K. Meditsiiniline mikrobioloogia / toim. akad. RAMS V.I. Pokrovski - M.: GEOTAR-Media, 2001. – 768 lk.

4. Borisov L.B. Mikrobioloogia praktiliste tundide juhend. M. 1997

Lisaks:

1. Genkel P.A., Mikrobioloogia viroloogia alustega. M., 1974

2. Korotyaev A.I., Babichev S.A. Meditsiiniline mikrobioloogia, immunoloogia ja viroloogia: mee õpik. ülikoolid – 3. väljaanne, muudetud. ja täiendav – Peterburi, SpetsLit. 2002. – 591 lk.

3. Borisov L.B., Smirnova A.M., Meditsiiniline mikrobioloogia, viroloogia, immunoloogia, M., Meditsiin. 1994. aasta

4. Timakov V.D., Levashov V.S., Borisov L.B. Mikrobioloogia. M. 1983

Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA)

Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA) viiakse läbi kahes etapis: esimene on antikehade interaktsioon antigeeniga, teine ​​on antigeeni-antikeha kompleksi ensümaatiline näit, mis on tingitud värvi ilmnemisest reaktsioonisegus ja värvi registreerimine visuaalselt või spektrofotomeetrilise meetodiga. .

ELISA jaoks on kaks võimalust: tahkefaas ja vedelfaas, mis erinevad immunokeemilise reaktsiooni komponentide eraldamise meetodi poolest. Võrreldes eelnevalt kirjeldatud antigeenide ja antikehade tuvastamise meetoditega, on ELISA-l olulisi eeliseid:

kõrge tundlikkus, mis võimaldab tuvastada kuni 0,05 ng/ml ainet;

võimalus kasutada katsematerjali minimaalsetes kogustes (1--2 µl);

reaktsiooni instrumentaalse või visuaalse salvestamise võimalus;

väljendusvõime ja võime automatiseerida kõiki reaktsiooni etappe.

ELISA-d kasutatakse praegu praktikas laialdaselt paljude bakteriaalsete, seente etioloogiaga nakkushaiguste, algloomade infektsioonide ja helmintiaaside, kuid eriti viirusnakkuste, eriti A-, B-, C-, D-, E-, G-hepatiidi, HIV-nakkuse, herpesviiruse, rotaviirus, adenoviirus, astroviirus, parvoviirus ja muud infektsioonid.

Immuunbloteerimine

Immunoblotanalüüsi meetodi põhimõte on tuvastada patogeeni üksikute antigeenide vastaseid antikehi. Selle meetodi abil määratakse HIV-antigeenide (viiruse ümbrise glükoproteiinid, tuumavalgud ja viiruse ensüümid) vastased antikehad. Immunoblotanalüüsi tulemusi hinnatakse positiivseks, kaheldavaks ja negatiivseks sõltuvalt tuvastatud antikehade kvantitatiivsest ja kvalitatiivsest komplektist.

Tuleb märkida, et immuunblotanalüüs on ELISA suhtes halvem, mõnel juhul võib HIV-nakkuse korral registreerida negatiivse tulemuse. HIV-nakkuse ELISA valepositiivsete tulemuste registreerimise võimalus nõuab aga HIV-nakkuse diagnoosimisel integreeritud lähenemist, võttes lisaks immunoloogiliste reaktsioonide (ELISA, immunoblotanalüüs) tulemustele arvesse epidemioloogilisi ja kliinilisi andmeid.

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)

PCR-meetodi töötas välja Ameerika biokeemik Kary Mullis 1983. aastal, tuginedes tema avastatud termostabiilse DNA polümeraasi (Tag polymerase) kasutamisele. Meetodi põhimõte on suurendada patogeeni spetsiifilise DNA piirkonna koopiate arvu 10 6 - 10 8 korda, mida katalüüsib in vitro DNA polümeraas automaatrežiimis.

Kunstlikes tingimustes on konkreetsele patogeenide liigile või perekonnale spetsiifilise genoomi piirkonna replikatsiooniprotsessi replikatsiooniprotsess võimalik eeldusel, et selle nukleotiidjärjestus on teada. Selliste piirkondade replikatsiooniproduktide (amplikonide) tuvastamise meetodite kasutamine võimaldab meil määrata patogeeni olemasolu uuritavas proovis.

Eespool kirjeldatud ahelate täiendav lõpetamine algab ainult teatud lähteplokkidest, mis on lühikesed kaheahelalised lõigud. Kui sellised plokid on kinnitatud DNA spetsiifiliste osade külge, suunatakse uue ahela sünteesiprotsess ainult valitud sektsiooni, mitte kogu DNA ahela pikkuses. Algplokkide loomiseks teatud DNA osades kasutatakse kahte oligonukleotiidpraimerit, mida nimetatakse praimeriteks. Praimerid on komplementaarsed DNA järjestustega konkreetse fragmendi vasakul ja paremal piiril ning on orienteeritud nii, et uue DNA ahela valmimine toimub ainult nende vahel.

TO PCR-meetodi eelised peaks sisaldama:

kõrge tundlikkus, mis võimaldab määrata proovis 10-1000 rakku;

kõrge spetsiifilisus, kuna katsematerjal paljastab konkreetse patogeeni jaoks ainulaadse DNA fragmendi;

erinevate patogeenide tuvastamise protseduuri universaalsus ühest bioproovist;

Suur analüüsi kiirus (4--4,5 h);

Võimalus diagnoosida mitte ainult ägedaid, vaid ka latentseid infektsioone.

PCR-i kasutamine on efektiivne paljude bakteriaalsete ja viirusnakkuste diagnoosimiseks.

Viimasel ajal on üsna edukalt rakendatud PCR analüüsi kvantitatiivseid meetodeid, mis võimaldavad määrata patogeeni kontsentratsiooni materjalis (mikroobne või viiruskoormus), näiteks hinnata B-hepatiidi viiruse, HIV C viiruse replikatiivset aktiivsust. .

Siiski tuleb meeles pidada, et ka PCR-meetodil on omad piirangud, eelkõige oportunistliku autofloora põhjustatud infektsioonide diagnoosimisel.

Nukleiinhapete hübridisatsioon

Nukleiinhapete hübridisatsioon, sarnaselt PCR-iga võimaldab see ilma eelneva isolatsioonita tuvastada proovis patogeeni. Analüüsi läbiviimiseks sünteesitakse üheahelaline DNA või RNA sond, mis on komplementaarne patogeeni spetsiifiliste nukleotiidjärjestustega. Sond on märgistatud radionukliidi, ensüümi või muu kergesti äratuntava märgisega. Uuritavat materjali töödeldakse biotestis esinevate mikroorganismide lüüsimiseks, DNA eraldamiseks ja denatureerimiseks. Järgmisena inkubeeritakse sondi uuritava prooviga ja mõõdetakse märgistatud DNA kogus, mis on hübridiseerunud uuritavas proovis oleva DNA-ga. Reaktsioon võib toimuda nii tahkefaasilistel sorbentidel kui ka lahuses, kuid eeltingimuseks on märgistatud sondi sidumata koguste pesemine. Nukleiinhapete hübridisatsioonimeetodi tundlikkus on madalam PCR-i omast ja on proovis 10 3 mikroobirakku.