الشعاب المرجانية
يعتمد تفاعل التألق المناعي على تفاعل الأجسام المضادة للكلاميديا مع مستضد الكلاميديا الخاص بالجنس. هناك نوعان من تفاعل التألق المناعي - المباشر وغير المباشر. في الحالة الأولى، يتم تمييز الجسم المضاد المحدد مباشرة بالفلوروكروم ويحدث التفاعل في خطوة واحدة، مما يقلل بشكل كبير من وقت البحث. في الحالة الثانية، لا يتم وضع علامة على الجسم المضاد المحدد، وللكشف عن مركب AG-AT المتكون في المرحلة الأولى، يتم استخدام الأجسام المضادة ذات العلامة الثانية الخاصة بالأجسام المضادة للكلاميديا. يتم تقييم نتيجة التفاعل بصريا باستخدام مجهر الفلورسنت.
بالإضافة إلى المستوردة، ظهرت مجموعات محلية لتشخيص عدوى المتدثرة عن طريق تفاعل التألق المناعي المباشر، والتي تكون متساوية عمليا في الخصوصية والحساسية، ولكن سعرها أقل بكثير.
مادة الدراسة هي مسحات بصمات الأصابع المعدة وفقًا للقواعد. يتم تحضير مسحات RIF على نظارات خاصة داخل منطقة محدودة يبلغ قطرها 8 - 10 ملم. بعد ذلك، يتم تجفيفها في الهواء وتثبيتها عن طريق غمرها في كحول إيثيلي بارد بنسبة 96٪ (يفضل المطلق) لمدة 5 - 10 دقائق أو تطبيق 0.1 - 0.15 مل من الأسيتون اللامائي المبرد على المستحضر حتى يتبخر تمامًا. يمكن فحص المستحضرات الثابتة على الفور أو، إذا لزم الأمر، تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة أو عند -20 درجة مئوية لمدة أسبوعين (من الضروري استبعاد الوصول إلى الرطوبة أثناء التخزين وإحضار المستحضر إلى درجة حرارة الغرفة قبل الفحص باستخدام قطعة بلاستيكية كيس وهلام السيليكا).
عند إجراء RIF المباشر، يتم تطبيق محلول من الأجسام المضادة المسمى على المستحضر بالكمية اللازمة لتغطية اللطاخة بالكامل (25 - 30 ميكرولتر). يتم تحضين الدواء في وضع أفقي في غرفة رطبة لمدة 15 دقيقة عند +37 درجة مئوية. تجفيف الكاشف غير مقبول لتجنب النتائج الإيجابية الكاذبة. بعد ذلك، تُغسل اللطاخة بالماء الجاري لمدة 30 ثانية، وتُشطف بالماء المقطر، وتُجفف وتُجهز للفحص المجهري.
عند إجراء RIF غير المباشر، يتم تطبيق الكمية المطلوبة من محلول الجسم المضاد المضاد للكلاميديا على المستحضر ويتم تنفيذ الحضانة الأولى تحت نفس الظروف كما في RIF المباشر. بعد ذلك يتم غسل المستحضر وتجفيفه في الهواء ويتم تطبيق كاشف ثانٍ - أجسام مضادة موسومة بالأجسام المضادة للكلاميديا ويتم أيضًا إجراء حضانة ثانية في غرفة رطبة عند درجة حرارة +37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد الغسيل، يتم تجفيف العينة وإعدادها للفحص المجهري. يوصى بمشاهدة الاستعدادات النهائية على الفور. إذا لزم الأمر، من الممكن تخزين المستحضرات الملونة لمدة 1-2 أيام عند +2-8 درجة مئوية في مكان مظلم دون الوصول إلى الرطوبة.
يتم إجراء الفحص المجهري باستخدام نظام الغمر. هناك خياران للمجهر الغمر:
1. الغمر بالزيت: ضع 20 - 25 ميكرولتر من سائل التركيب (الجلسرين، مخفف بمحلول فوسفات مع درجة حموضة 7.2 - 7.6) على المستحضر المجفف النهائي، وقم بتغطيته بغطاء زجاجي خالي من الدهون، حيث يتم وضع قطرة من مادة غير مفلورة. يتم بعد ذلك تطبيق زيت الغمر وفحصه مجهريا باستخدام عدسة موضوعية (تحمل علامة "L" - مضيئة) بتكبير 90 وعدسة عينية بتكبير 5.
2. الغمر في الماء: يتم وضع قطرة من 20 ميكرولتر من محلول الفوسفات مع درجة حموضة 7.4 على المستحضر النهائي ويتم فحصها مجهريا باستخدام عدسة غمر في الماء (مميزة بشريط أبيض و"L" - مضيء) مع تكبير 60 و عدسة تكبير 5. يمنح الغمر في الماء توهجًا أكثر إشراقًا ووضوحًا.
يتيح لك RIF تحديد الهياكل المستضدية لكل من الأجسام الأولية والشبكية. تقع ETs في الغالب خارج الخلية، مستديرة الشكل مع حواف ناعمة، صغيرة (الحجم 1:100 - 1:150 بالنسبة للخلايا المحيطة)، بنية متجانسة، لها توهج أخضر زمردي محدد ومشرق، والذي، عند استخدامه مع المسمار المجهري، يمكن أن تنتج حلقات الحيود (حلقات Dilektorsky). تعد RTs أقل شيوعًا، وتقع في الغالب داخل الخلايا، ولها بنية أقل اتساقًا، وأكثر تعدد الأشكال، ولكن أيضًا ذات حواف واضحة ولها توهج أخضر زمردي محدد ومشرق. تعتبر مادة أخرى مصنوعة من مادة الفلورسنت ذات الشكل غير المنتظم أو الحواف غير المستوية أو غير الواضحة أو ذات اللون الأخضر الخافت أو الوهج بلون مختلف. تعتمد شدة التوهج المحدد وسطوعه وظله على الرقم الهيدروجيني لسائل التركيب أو المخزن المؤقت المستخدم في الفحص المجهري. تزيد الكثافة العالية لتلألؤ FITC في بيئة قلوية من حساسية الطريقة، ولكنها تؤدي إلى زيادة في عدد الكائنات ذات التلألؤ غير المحدد، وبالتالي إلى نتائج إيجابية كاذبة. في بيئة حمضية، تنخفض شدة توهج FITC، مما قد يعطي نتيجة سلبية كاذبة. إن النباتات الدقيقة المصاحبة، وكذلك نوى الخلايا المحيطة، ملطخة بشكل غير محدد بظلال مختلفة من اللون البرتقالي مع بروميد الإنديوم، والسيتوبلازم الخاص بها ملطخ بظلال مختلفة من اللون البني القرميدي مع أزرق إيفانز.
للحصول على نتيجة موثوقة، يوصى بمشاهدة العديد من مجالات رؤية الدواء. تعتبر النتيجة إيجابية إذا كان المستحضر يحتوي على خلايا ظهارية ومن الممكن اكتشاف ما لا يقل عن 6 أجسام أولية تتمتع بجميع الخصائص المذكورة أعلاه.
اكتشاف كمية أقل من العامل الممرض يجعل النتيجة مشكوك فيها ويتطلب بحثًا متكررًا، ويفضل أن يكون ذلك على خلفية الاستفزاز (الطعام - الكحول، الدواء - الحقن البيروجيني، التدليك الميكانيكي - الإحليل على العربة). يجب أن تتم السيطرة على العلاج في موعد لا يتجاوز أسبوعين، لأنه من الممكن أن تبقى مادة مستضدية غير قابلة للإزالة لمسبب مرض غير قابل للحياة، مما سيعطي نتائج إيجابية كاذبة. الحصول على 3 نتائج سلبية لدى الرجال خلال شهر واحد وعند النساء خلال 3 دورات شهرية، يشير غياب المظاهر السريرية لعدوى المتدثرة إلى الشفاء.
يعد RIF، مع الإعداد المناسب للمريض، والامتثال لقواعد تناول المواد وتنظيم التفاعل، طريقة حساسة للغاية ومحددة لتشخيص الكلاميديا البولية التناسلية وتسمح بتحديد العامل الممرض في 90 - 95٪ من المرضى. هذه الطريقة رخيصة نسبيًا وسهلة التنفيذ وغنية بالمعلومات ولا تتطلب معدات خاصة باهظة الثمن وتسمح لك بالحصول على النتائج بسرعة (0.5 - 1 ساعة) والتحكم بصريًا في جودة المواد المأخوذة للبحث.
طرق استخدام مبادئ البيولوجيا الجزيئية
تتضمن المجموعة طرق تحقيقات الحمض النووي وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، والتي تتيح التعرف على المادة الوراثية للعامل الممرض في المادة الحيوية قيد الدراسة. لا تزال مجموعات تشخيص الكلاميديا باستخدام مجسات الحمض النووي في مرحلة التطوير والتجارب السريرية.
يتم إدخال PCR بنشاط في ممارسة التشخيص المختبري. تعتمد الطريقة على عزل تسلسل DNA أو RNA محدد للعامل الممرض باستخدام البادئات التكميلية، ونسخها المتكرر اللاحق وتراكمها لمزيد من الكشف عن طريق طرق الكشف التقليدية (الرحلان الكهربائي أو ELISA). تتميز هذه الطريقة بخصوصية وحساسية عالية، تقترب تقريبًا من الطريقة الثقافية، وتجعل من الممكن اكتشاف مسببات الأمراض الفردية في المادة قيد الدراسة. تتطلب طريقة PCR معدات خاصة باهظة الثمن، ومختبرًا منفصلاً مجهزًا بشكل خاص، وتدريبًا مناسبًا وعاملين طبيين مؤهلين تأهيلاً عاليًا. في الوقت نفسه، فإن الافتقار إلى شهادة الاشعال المستخدمة في روسيا والخبرة الكافية في استخدام طريقة PCR، وخصوصية المادة التي يتم اختبارها، وتلوثها المتكرر بالنباتات الدقيقة المصاحبة (والتي يمكن أن تعطي نتائج إيجابية كاذبة) لا تسمح علينا أن نحكم بوضوح على قيمته في تشخيص الكلاميديا البولية التناسلية.
وبالتالي، فإن الطريقة الأكثر سهولة وبساطة وفي نفس الوقت الغنية بالمعلومات لتشخيص الكلاميديا البولية التناسلية وتحديد العلاج هي تفاعل التألق المناعي المباشر (RIF). ينبغي مراقبة ديناميكيات المرض وفعالية العلاج من خلال تحديد عيار الأجسام المضادة للكلاميديا في مصل الدم باستخدام مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
هناك خياران لتنظيم RIF (تفاعل Coons) - تفاعلات التألق المناعي المباشر وغير المباشر.
يعد Direct RIF بمثابة تفاعل بسيط من خطوة واحدة، ولكنه يتطلب كمية كبيرة من
الأمصال المضادة للميكروبات، ثم يتم وضعها بشكل غير مباشر في كثير من الأحيان، ويتم ضمان وضعها بواسطة مصل مضاد واحد.
RIF غير المباشر هو تفاعل مكون من خطوتين يتم فيه ربط المستضد أولاً بمصل الأنواع غير المسمى، ثم تتم معالجة المركب المناعي للجسم المضاد للمستضد المتكون بمصل مضاد يحمل علامة FITC يحتوي على أجسام مضادة ضد الغلوبولين المناعي لهذا المركب. عادةً، في المرحلة الأولى من إنتاجه، يتم استخدام مصل الأرانب المناعي الذي تم الحصول عليه عن طريق تحصين الحيوانات بالكائنات الحية الدقيقة المقابلة كمصل للأنواع، وفي المرحلة الثانية، يتم استخدام مصل مضاد للأرانب يحمل علامة FITC للحمير أو الحيوانات الأخرى المحصنة بجلوبيولين جاما للأرنب ( الشكل 9).
إعداد RIF المباشر. على شريحة زجاجية خالية من الدهون، يتم عمل مسحات رقيقة من المادة التي يتم فحصها، ويتم عمل مسحات بصمات الأصابع من الأعضاء والأنسجة. يتم تجفيف المستحضرات وتثبيتها وتطبيق مصل الإنارة المأخوذ في تخفيف العمل عليها ووضعها في غرفة رطبة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة (لمدة 25-40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة). بعد ذلك، لإزالة الأجسام المضادة الفلورية الزائدة، يتم غسل المستحضر في محلول كلوريد الصوديوم متساوي التوتر لمدة 10-15 دقيقة، يليه الشطف في الماء المقطر أو الجاري لمدة 10 دقائق. تجف في درجة حرارة الغرفة وتفحص تحت المجهر الفلوري باستخدام نظام الغمر بالزيت.
لتقييم شدة مضان معين من الخلايا البكتيرية، يتم استخدام مقياس أربعة زائد: "++++"، "+++" - مشرق للغاية ومشرق؛ "++" ، "+" - مضان أخضر واضح وضعيف للخلايا. هناك حاجة إلى ثلاثة ضوابط: 1) العلاج بالأجسام المضادة الفلورية للبكتيريا المتجانسة (التحكم الإيجابي)؛ 2) الثقافة غير المتجانسة (التحكم السلبي)؛ 3) المواد غير الملوثة (التحكم السلبي).
مكافحة التكميلية RIF. التفاعل عبارة عن تعديل لـ RSC، ونظام المؤشر الخاص به عبارة عن أجسام مضادة مضادة للتكميلية تحمل علامة FITC (الشكل 10).
يتم إجراء الـ RIF المضاد غير المباشر على النحو التالي: يتم تحضير المستضد على شريحة زجاجية، كما هو الحال في الـ RIF، ولكن في المرحلة الأولى لا يتم معالجته بالمصل المناعي وحده، ولكن بخليطه مع مكمل خنزير غينيا، وفي المرحلة الثانية. مع مصل مضاد يحتوي على أجسام مضادة تحمل علامة FITC لتكملة . إن الاستخدام الواسع النطاق لـ RIF المضاد للتكميلية محدود بسبب صعوبة الحصول على الأجسام المضادة المضادة للتكميلية وطريقة "توسيمها".
تم اكتشاف تفاعل التألق المناعي في عام 1942 بواسطة كونز، وهو ليس طريقة بحث جديدة. ومع ذلك، فإن ظهور تقنيات الورم الهجين، التي مكنت من الحصول على الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، أعطى "حياة ثانية" لهذا التفاعل، حيث أن استخدامها جعل من الممكن زيادة حساسية هذا التفاعل وخصوصيته عدة مرات.
واليوم سنخبرك بالتفصيل عن تفاعل التألق المناعي المباشر وغير المباشر (RIF) كطريقة تشخيصية لكونز للرجال والنساء البالغين أثناء الحمل.
ما هو رد الفعل المناعي؟
يمثل فرصة ممتازة للحصول بسرعة على تشخيص دقيق، تفاعل التألق المناعي يجعل من الممكن تحديد وجود العامل المسبب للمرض في المادة المرضية. لهذا الغرض، يتم استخدام مسحة من المواد، والتي تتم معالجتها خصيصًا باستخدام علامة FITC (إيزوثيوسيانات الفلورسين)، ويتم دراستها كتحليل غير متجانس.
للحصول على النتيجة، يتم استخدام مجهر فلوري يحتوي نظامه البصري على مجموعة من المرشحات الضوئية لتزويد الدواء بضوء أزرق بنفسجي أو فوق بنفسجي بطول موجي معين. تسمح هذه الحالة للفلوروكروم بالانعكاس ضمن نطاق معين. يقوم الباحث بتقييم خصائص التوهج وطبيعته وحجم الأشياء وموقعها النسبي.
لمن يوصف؟
يمكن وصف تفاعل التألق المناعي لتشخيص العديد من الأمراض الفيروسية. على وجه الخصوص، يوصف أثناء الفحص الشامل لتحديد العوامل التالية:
- وجود فيروس في الجسم.
- عدوى السالمونيلا.
- وجود مستضدات معينة في الجسم.
- تم تحديد احتمالية إصابة الجسم بالكلاميديا والميكوبلازما والكائنات الحية الدقيقة الأخرى التي لديها القدرة على التسبب في أمراض فيروسية لدى البشر.
- تشخيص الأمراض الفيروسية في الحيوانات.
تتيح المؤشرات المذكورة استخدام تفاعل التألق المناعي للكشف عن الأمراض الفيروسية ذات الطبيعة المختلفة في جسم الإنسان والحيوان.
أهداف
وبما أن هذه الطريقة التشخيصية لها مزايا عديدة، منها كفاءتها العالية وسرعة تنفيذها والحصول على النتائج، فضلا عن عدم وجود عدد كبير من موانع الاستعمال، فإنها تستخدم لتحديد وجود الالتهابات الفيروسية في الجسم. لذلك، يمكن وصف هذا التحليل لتحديد وتوضيح التشخيص، وعلى أساسه يتم وصف نظام العلاج.
الإجراء لا يسبب أي إزعاج، فهو يتطلب الحصول على مادة للتحليل، وهي مأخوذة من أي سوائل في الجسم: اللعاب، البلغم، كشط من سطح الأغشية المخاطية. يمكن أيضًا أخذ الدم للاختبار. يتم تحديد وتيرة رد الفعل المناعي من قبل الطبيب المعالج، الذي يحتاج إلى الحصول على بيانات عن ديناميات العمليات التي تحدث في الجسم.
وبما أن هذا التحليل لا يسبب ضررا للجسم أو للرفاهية العامة للشخص، فيمكن وصفه عند الضرورة.
أنواع مثل هذا الإجراء
اليوم، يتم استخدام عدة أنواع من هذا التحليل، كل منها يحتوي على عدد من الميزات المحددة ويسمح لك بالحصول على الصورة الأكثر تفصيلا للعمليات التي تحدث في الجسم.
تشمل أنواع تفاعلات التألق المناعي ما يلي:
- - أحد أسرع أنواع التشخيص تطورًا، حيث يتيح هذا التحليل الحصول على بيانات كمية دون استخدام التخفيفات التسلسلية. باستخدام القياسات التي تم الحصول عليها للكثافة البصرية للسائل، من الممكن تحديد مستوى تركيز المكون المطلوب بدقة. يتم استخدام الإمكانيات الواسعة لهذا النوع من التحليل عند استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة لتنفيذه، مما يجعل من الممكن تحديد مرحلة العملية المعدية وشدتها؛
- تشخيص الحمض النووي- تعتمد هذه الطريقة على الارتباط التكميلي للنيوكليوتيدات، حيث يمكن استخدام السوائل مثل اللعاب والدم والسائل النخاعي والبول والبلغم وعينات الخزعة والدم. تكتشف هذه الطريقة بشكل أكثر فعالية وجود فيروسات الورم الحليمي في الجسم، ومع ذلك، فإن العديد من أنظمة الاختبار الحديثة يمكن أن تعطي أحيانًا نتائج إيجابية وسلبية كاذبة. وقد يكون سببها تلوث عينات سائلة لتحليل حمض نووي محدد، والذي قد يكون وجوده ذا طبيعة متداخلة أو كلية؛
- اللوني المناعي— خصوصية هذه الطريقة لتحديد وجود البيئة المرضية والفيروسات في الجسم هو استخدام الأجسام المضادة المسمى أثناء التفاعل. يتم استخدام هذه الطريقة التشخيصية لتحديد ودرجة نشاط عملية الإصابة بالمكورات العقدية من المجموعة أ، وكذلك الكلاميديا من الأنواع التالية: Clamikit R Innotech International، Clearview TM Chlamydia من Oxoid. تمتلك أعلى حساسية ممكنة، وأنظمة الاختبار التي تعتمد على طريقة البحث هذه. وعادة ما تستخدم كاختبار إرشادي.
تتميز الأصناف المدرجة بميزات تنفيذها وخصائص محددة للنتائج، ولكن جميعها تهدف إلى الحصول على بيانات عن وجود الكائنات الحية الدقيقة المرضية والفيروسات في الجسم، وكذلك عن درجة تكاثرها ونشاطها.
مؤشرات للاستخدام
يمكن وصف تفاعل التألق المناعي لتحديد أي نوع من البيئة المرضية في الجسم.
يتم تحديد الكلاميديا، المشعرة، المكورات البنية، وكذلك الجيارديا بجميع أنواعها خلال هذا النوع من التشخيص. والأمراض الأخرى تتطلب أيضًا RIF. مطلوب موعد مع الطبيب لتنفيذه.
موانع ل
نظرًا لأن هذا التفاعل يتطلب أي نوع من سوائل الجسم كمواد اختبار، فإن أخذها ليس بالأمر الصعب عادةً ولا توجد موانع لإجراء تفاعل التألق المناعي. ومع ذلك، أثناء الحمل والأطفال دون سن 6 أشهر، يتم جمع المواد للبحث مع أقصى الاحتياطات.
يسمح غياب موانع الاستعمال بإجراء هذا النوع من التشخيص عندما يصفه الطبيب لجميع المرضى. يتم ضمان سلامتها من خلال استخدام الأدوات المطهرة والمحاقن التي يمكن التخلص منها.
التحضير لهذا الإجراء
لا توجد خصوصيات فيما يتعلق بجمع المواد لهذا التحليل. ويتم أخذ الدم المخصص لذلك على معدة فارغة حتى لا تزيد فيه نسبة المواد التي يمكن أن تغير القراءات الحقيقية وتعطي صورة خاطئة.
كيف يتم إجراء الاختبار؟
وبما أنه لا يتطلب إجراء أي تحضيرات خاصة للتحليل، يتم تناول الطعام فقط قبل 12 ساعة من إجراء الاختبار ويستبعد عدم استخدام الأدوية، ويتم أخذ مادة الاختبار كعملية عادية لأخذ سوائل الجسم للتحليل.
قد تختلف الأحاسيس الذاتية أثناء الإجراء حسب الحساسية.
فك تشفير النتائج
يتيح لك استخدام أنظمة الاختبار الحديثة الحصول على نتائج التحليل الأكثر دقة. لفك النتيجة، يتم استخدام البيانات التالية:
- درجة كثافة مضان.
- الظل مضان.
- الطبيعة المحيطية لعملية تلألؤ الجسم؛
- خصائص التشكل، وموقع العامل الممرض في مسحة مادة الاختبار وحجمه.
عند دراسة الأجسام الكبيرة (على سبيل المثال، Gardenerella، Trichomonas، الخلايا المصابة بالفعل بالفيروسات)، فإن المعايير المذكورة أعلاه تجعل من الممكن الحصول على النتائج الأكثر موثوقية. ومع ذلك، فإن الأجسام الأولية للميكوبلازما والكلاميديا لها أحجام تقع في حدود قدرات التحليل للمجهر الفلوري، مما يجعل الأمر صعبًا
يجعل من الصعب الحصول على نتيجة دقيقة، لأن التوهج المحيطي يفقد بعضًا من شدته. ولم تعد المعايير المتبقية كافية لتحديد دقيق للكائنات الحية الدقيقة قيد الدراسة. لهذا السبب، يتم فرض متطلبات خاصة على المتخصصين الذين يقومون بهذا النوع من الأبحاث: يجب أن يكون مستوى مؤهلاتهم كافيًا للعمل مع البيانات المتاحة.
لهذا السبب، لا يمكن إلا للطبيب ذو المستوى المناسب من المؤهلات تفسير التحليل الذي تم الحصول عليه. اقرأ أدناه عن سعر البحث باستخدام طريقة RIF.
متوسط السعر
يعتمد سعر رد الفعل المناعي على موقع ومستوى المؤسسة الطبية، بالإضافة إلى مؤهلات الأخصائي الذي يقوم بالتحليل. اليوم تتراوح التكلفة من 1280 إلى 2160 روبل.
سيخبرك الفيديو أدناه بالمزيد عن التفاعلات المناعية:
تستخدم هذه الطريقة ظاهرة التلألؤ.
جوهر ظاهرة التلألؤ هو أنه عندما تمتص جزيئات مواد معينة أنواعًا مختلفة من الطاقة (الضوء، والكهرباء، وما إلى ذلك)، فإن ذراتها تدخل في حالة مثارة، ثم تعود إلى حالتها الأصلية، وتطلق الطاقة الممتصة على شكل إشعاع ضوئي.
في RIF، يظهر التلألؤ على شكل مضان - وهو توهج يحدث في لحظة التشعيع بضوء مثير ويتوقف فور اكتماله.
العديد من المواد والكائنات الحية الدقيقة لها مضانها الخاص (ما يسمى بالابتدائي)، ولكن كثافته منخفضة للغاية. تسمى المواد التي لها مضان أولي مكثف وتستخدم لنقل خصائص الفلورسنت إلى المواد غير الفلورية بالفلوروكروم. ويسمى هذا مضان المستحث الثانوية.
لإثارة التألق أثناء الفحص المجهري للتلألؤ، يتم استخدام الجزء فوق البنفسجي أو الأزرق البنفسجي من الطيف (الطول الموجي 300-460 نانومتر) في أغلب الأحيان. لهذه الأغراض، تحتوي المختبرات على مجاهر الفلورسنت من نماذج مختلفة - ML-1-ML-4، "Lumam".
في الممارسة الفيروسية، يتم استخدام طريقتين رئيسيتين للفحص المجهري الفلوري: التألق الفلوري والأجسام المضادة الفلورية (أو FIF).
طلاء الفلوروكروم- يتم العلاج بالأدوية بالفلوروكروم من أجل زيادة قوة وتباين توهجها. الأكثر أهمية هو برتقال أكريدين الفلوروكرومي، الذي يسبب مضان متعدد الألوان للأحماض النووية. وهكذا، عندما يتم علاج الأدوية بهذا الفلوروكروم، يتألق حمض الديوكسي ريبونوكلييك باللون الأخضر الزاهي، ويتألق حمض الريبونوكلييك باللون الأحمر الياقوتي.
تعتمد طريقة RIF على حقيقة أن الأجسام المضادة المدمجة مع الفلوروكروم تحتفظ بالقدرة على الدخول في رابطة محددة مع مستضد متماثل. يتم الكشف عن المستضد الناتج + مركب الجسم المضاد، بسبب وجود الفلوروكروم فيه، تحت المجهر الفلوري من خلال توهجه المميز.
للحصول على الأجسام المضادة، يتم استخدام الأمصال مفرطة المناعة النشطة للغاية، والتي يتم عزل الأجسام المضادة منها وتمييزها بالفلوروكروم. الفلوروكرومات الأكثر استخدامًا هي FITC-فلوريسئين إيزوثيوسيانات (الضوء الأخضر) وPCX-رودامين سلفوكلوريد (الضوء الأحمر). تسمى الأجسام المضادة الموسومة بالفلوروكروم مترافقة.
إجراءات تحضير وتلطيخ الاستعدادات هي كما يلي:
- تحضير المسحات والمطبوعات من الأعضاء على شرائح زجاجية أو زراعة الخلايا المصابة على قسائم الغلاف؛ يمكن أيضًا استخدام عمليات الاستئصال النسيجي؛
- يتم تجفيف المستحضرات في الهواء وتثبيتها في الأسيتون المبرد في درجة حرارة الغرفة أو عند درجة حرارة 15 درجة مئوية تحت الصفر (من 15 دقيقة إلى 4-16 ساعة)؛
- ملطخة بطريقة مباشرة أو غير مباشرة؛ الاحتفاظ بالسجلات تحت مجهر فلوري استناداً إلى شدة التوهج، المقدرة بالصلبان.
في الوقت نفسه، يتم إعداد الاستعدادات من حيوان صحي وملطخة - التحكم.
هناك طريقتان رئيسيتان لاستخدام الأجسام المضادة الفلورية: المباشرة وغير المباشرة.
الطريقة المباشرة (خطوة واحدة). يتم تطبيق المترافق (مصل الفلورسنت للفيروس المفترض) على المستحضر الثابت ويتم الاحتفاظ به لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في غرفة رطبة. بعد ذلك، يتم غسل المستحضر من المادة المترافقة غير المرتبطة بمحلول فسيولوجي (درجة الحموضة 7.2 - 7.5)، وتجفيفه في الهواء، ويتم وضع زيت غير فلورسنت وفحصه تحت المجهر.
تسمح الطريقة المباشرة باكتشاف وتحديد المستضد. وللقيام بذلك، يجب أن يكون لديك مصل فلورسنت لكل فيروس.
الطريقة غير المباشرة (على مرحلتين). يتم تطبيق مصل غير مُسمى يحتوي على أجسام مضادة للفيروس المفترض على المستحضر الثابت، ويتم احتضانه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ويتم غسل الأجسام المضادة غير المرتبطة. يتم تطبيق مصل فلورسنت مضاد للأنواع المطابق لنوع الأجسام المضادة المضادة للفيروسات المتماثلة المنتجة للحيوان على المستحضر وحضنه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ثم يتم غسل المستحضر من الأجسام المضادة غير المقيدة، وتجفيفه في الهواء، ويتم وضع زيت غير فلوري وفحصه تحت مجهر فلوري.
يتم الحصول على الأمصال المضادة للأنواع عن طريق تحصين حيوانات الجلوبيولين من تلك الأنواع التي تعمل كمنتجة للأجسام المضادة للفيروسات. لذلك، إذا تم الحصول على الأجسام المضادة المضادة للفيروسات في الأرانب، فسيتم استخدام مصل الفلورسنت المضاد للأرانب.
لا تسمح الطريقة غير المباشرة باكتشاف المستضد وتحديده فحسب، بل تسمح أيضًا باكتشاف وتحديد عيار الجسم المضاد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذه الطريقة اكتشاف مستضدات الفيروسات المختلفة باستخدام مصل واحد، لأنها تعتمد على استخدام الأمصال المضادة للأنواع. الأكثر استخدامًا هي الأمصال المضادة للأرانب، والمضادة للأبقار، والمضادة للخيول، والأمصال المضادة للجلوبيولين المضاد للخنازير الغينية.
وقد تم تطوير العديد من التعديلات على الطريقة غير المباشرة. طريقة استخدام المكملات تستحق أكبر قدر من الاهتمام. تتكون الطريقة من تطبيق مصل محدد غير مفلور معطل ومكمل لخنزير غينيا على مستحضر ثابت، والاحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، والغسل، وتحديد المستضد + الجسم المضاد + المركب المكمل، وتطبيق مصل الفلورسنت المضاد التكميلي والحضانة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، يتم غسلها وتجفيفها بالهواء وفحصها تحت المجهر الفلوري.
مزايا RIF: خصوصية وحساسية عالية؛ بساطة تقنية التدريج. مطلوب الحد الأدنى لعدد المكونات. هذه طريقة تشخيصية سريعة، حيث يمكنك الحصول على إجابة في غضون ساعات قليلة. وتشمل العيوب الذاتية في تقييم شدة التوهج، ولسوء الحظ، في بعض الأحيان تكون أمصال الفلورسنت ذات نوعية رديئة. حاليًا، يستخدم RIF على نطاق واسع في تشخيص الأمراض الحيوانية الفيروسية.
إذا وجدت خطأ، يرجى تحديد جزء من النص والنقر عليه السيطرة + أدخل.
61. رد فعل المناعي. الآلية والمكونات والتطبيق. طرق الإعداد المباشرة وغير المباشرة.
هناك ثلاثة أنواع رئيسية من الأساليب: المباشرة، وغير المباشرة (الشكل 13.10)، والمكملة. يعد تفاعل كونز طريقة تشخيصية سريعة لتحديد المستضدات الميكروبية أو تحديد الأجسام المضادة.
طريقة RIF المباشرة يعتمد على حقيقة أن مستضدات الأنسجة أو الميكروبات المعالجة بالأمصال المناعية بالأجسام المضادة الموسومة بالفلوروكرومات قادرة على التوهج في الأشعة فوق البنفسجية لمجهر الفلورسنت في البكتيريا في اللطاخة المعالجة بمثل هذا المصل المضيء على طول محيط الخلية شكل الحدود الخضراء.
طريقة RIF غير المباشرة يتكون من تحديد مركب المستضد والجسم المضاد باستخدام مصل مضاد الجلوبيولين (المضاد للأجسام المضادة) المسمى بالفلوروكروم. للقيام بذلك، يتم التعامل مع المسحات من تعليق الميكروبات بالأجسام المضادة من مصل تشخيص الأرانب المضاد للميكروبات. ثم يتم غسل الأجسام المضادة غير المرتبطة بالمستضدات الميكروبية، ويتم اكتشاف الأجسام المضادة المتبقية على الميكروبات عن طريق معالجة اللطاخة بمصل مضاد الجلوبيولين (مضاد للأرنب) المسمى بالفلوروكروم. ونتيجة لذلك، يتم تشكيل مجمع من الميكروبات + الأجسام المضادة للأرنب المضادة للميكروبات + الأجسام المضادة للأرنب الموسومة بالفلوروكروم. ويلاحظ هذا المجمع في المجهر الفلوري، كما هو الحال في الطريقة المباشرة.
تستخدم الأصباغ الفلورية المضيئة (فلوريسئين إيزوثيوسيانات، وما إلى ذلك) كملصقات.
هناك تعديلات مختلفة على RIF. للتشخيص السريع للأمراض المعدية، يتم استخدام Koons RIF لتحديد الميكروبات أو مستضداتها في مادة الاختبار.
هناك طريقتان لـ RIF وفقًا لكونز: المباشرة وغير المباشرة.
مكونات RIF المباشرة:
1) المادة التي يتم فحصها (البراز الذي يخرج من البلعوم الأنفي، وما إلى ذلك)؛
2) وصف المصل المناعي المحدد الذي يحتوي على AT-la للمستضد المطلوب؛
3) محلول كلوريد الصوديوم متساوي التوتر.
تتم معالجة اللطاخة من مادة الاختبار بمصل مضاد.
يحدث تفاعل AG-AT. أثناء الفحص المجهري المضيء، يتم اكتشاف التألق في المنطقة التي تتمركز فيها مجمعات AG-AT.
مكونات RIF غير المباشرة:
1) المادة قيد الدراسة.
2) مصل مضاد محدد.
3) مصل مضاد الجلوبيولين (AT-la ضد الغلوبولين المناعي)، المسمى بالفلوريكروم؛
4) محلول كلوريد الصوديوم متساوي التوتر.
تتم معالجة اللطاخة من مادة الاختبار أولاً بمصل مناعي للمستضد المطلوب، ثم بمصل مضاد الجلوبيولين المسمى.
يتم الكشف عن مجمعات AG-AT المضيئة - المسمى AT باستخدام مجهر فلوري.
ميزة الطريقة غير المباشرة هي أنه ليست هناك حاجة لإعداد مجموعة واسعة من الأمصال الفلورية المحددة، ولكن يتم استخدام مصل فلورسنت مضاد الجلوبيولين واحد فقط.
يوجد أيضًا نوع مكون من 4 مكونات من RIF غير المباشر، عند تقديم المكمل (مصل خنزير غينيا) بالإضافة إلى ذلك. في رد فعل إيجابي، يتم تشكيل مجمع AG-AT - المسمى - مكمل AT.