اللطخة المناعية (اللطخة المناعية، اللطخة الغربية، اللطخة الغربية)- يجمع بين مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) مع النقل الكهربي الأولي لمستضدات الفيروس على شريط النيتروسليلوز (الشريط).

في هذا الاسم العلمي الجميل، الأرجح أن كلمة "blot" تُترجم إلى "blot"، و"western" - إذ تعكس كلمة "western" اتجاه توزيع هذه "blot" على الورقة من اليسار إلى اليمين، أي على خريطة جغرافية تتوافق مع الاتجاه من الغرب إلى الشرق ". جوهر طريقة "اللطخة المناعية" هو أن تفاعل الإنزيم المناعي لا يتم باستخدام خليط من المستضدات، ولكن مع مستضدات فيروس نقص المناعة البشرية، التي تم توزيعها مسبقًا عن طريق الرحلان المناعي إلى أجزاء تقع وفقًا للوزن الجزيئي على سطح غشاء النيتروسليلوز. ونتيجة لذلك، يتم توزيع بروتينات فيروس نقص المناعة البشرية الرئيسية، الحاملة للمحددات المستضدية، على السطح في شكل خطوط منفصلة، ​​تظهر أثناء تفاعل الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم.

تتضمن Immunoblot عدة مراحل:

إعداد الشريط.يتعرض فيروس نقص المناعة البشرية (HIV)، الذي تم تنقيته مسبقًا وتدميره إلى مكوناته الأساسية، للرحلان الكهربائي، ويتم فصل المستضدات التي يتكون منها فيروس نقص المناعة البشرية بالوزن الجزيئي. بعد ذلك، باستخدام طريقة النشاف (المشابهة لضغط الحبر الزائد على وسادة النشاف)، يتم نقل المستضدات إلى شريط من النيتروسليلوز، والذي يحتوي الآن على طيف من العصابات المستضدية المميزة لفيروس نقص المناعة البشرية، والتي لا تزال غير مرئية للعين.

فحص العينة.يتم تطبيق مادة الاختبار (المصل، بلازما دم المريض، وما إلى ذلك) على شريط النيتروسليلوز، وإذا كانت هناك أجسام مضادة محددة في العينة، فإنها ترتبط بنطاقات مستضدية (مكملة) مقابلة تمامًا. نتيجة للتلاعبات اللاحقة، يتم تصور نتيجة هذا التفاعل - جعلها مرئية.

تفسير النتيجة.إن وجود أشرطة في مناطق معينة من صفيحة النيتروسليلوز يؤكد وجود أجسام مضادة لمستضدات فيروس نقص المناعة البشرية المحددة بدقة في المصل الذي تم اختباره.

قطاع أ-التحكم الإيجابي

الشريط ب - التحكم الإيجابي الضعيف

حارة C - التحكم السلبي

الخط D - عينة إيجابية (تم اكتشاف أجسام مضادة لفيروس نقص المناعة البشرية -1)

في الوقت الحالي، تعد اللطخة المناعية (immunoblot) هي الطريقة الرئيسية لتأكيد وجود الأجسام المضادة الخاصة بالفيروس في مصل الاختبار. في بعض حالات الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، قبل حدوث الانقلاب المصلي، يتم الكشف عن أجسام مضادة محددة بشكل أكثر فعالية عن طريق التطعيم المناعي مقارنة بـ ELISA. عند الدراسة باستخدام طريقة التطعيم المناعي، وجد أنه في أغلب الأحيان يتم اكتشاف الأجسام المضادة لـ gp 41 في أمصال المرضى المصابين بالإيدز، ويتطلب اكتشاف p24 لدى الأشخاص الذين تم فحصهم لأغراض وقائية بحثًا إضافيًا لتحديد ما إذا كانوا مصابين بفيروس نقص المناعة البشرية. أثبتت أنظمة اختبار النشاف المناعي المستندة إلى البروتينات المؤتلفة المهندسة وراثيًا أنها أكثر تحديدًا من الأنظمة التقليدية المعتمدة على المحللة الفيروسية النقية. عند استخدام مستضد مؤتلف، لا يتم تشكيل شريط مستضد منتشر، ولكن شريط مستضد ضيق محدد بوضوح، والذي يمكن الوصول إليه بسهولة للتسجيل والتقييم.

تكشف أمصال الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية-1 عن أجسام مضادة للبروتينات والبروتينات السكرية الرئيسية التالية - بروتينات الغلاف الهيكلي (env) - gp160، gp120، gp41؛ النواة (الكمامة) - p17، p24، p55، وكذلك الإنزيمات الفيروسية (pol) - p31، p51، p66. الأجسام المضادة للبيئة نموذجية بالنسبة لفيروس نقص المناعة البشرية-2 - gp140، gp105، gp36؛ الكمامة - ص16، ص25، ص56؛ بول - ص68.

من بين الطرق المختبرية اللازمة لتحديد خصوصية التفاعل، الأكثر شهرة هو اكتشاف الأجسام المضادة لبروتينات غلاف فيروس نقص المناعة البشرية-1 - gp41، gp120، gp160، وHIV-2 - gp36، gp105، gp140.

تعتبر منظمة الصحة العالمية الأمصال الإيجابية التي يتم فيها الكشف عن الأجسام المضادة لأي اثنين من البروتينات السكرية لفيروس نقص المناعة البشرية عن طريق التطعيم المناعي. وفقًا لهذه التوصيات، إذا كان هناك تفاعل مع بروتين واحد فقط من بروتينات الغلاف (gp 160، gp 120، gp 41) مجتمعًا أو بدون تفاعل مع بروتينات أخرى، فإن النتيجة تعتبر مشكوك فيها ويوصى بإعادة الاختبار باستخدام اختبار مجموعة من سلسلة مختلفة أو من شركة مختلفة. إذا ظلت النتيجة مشكوك فيها حتى بعد ذلك، يوصى بالمراقبة لمدة 6 أشهر (البحث بعد 3 أشهر).

قد يشير وجود تفاعل إيجابي مع المستضد p24 إلى فترة من الانقلاب المصلي، حيث تظهر الأجسام المضادة لهذا البروتين أولاً في بعض الأحيان. في هذه الحالة، يوصى، اعتمادًا على البيانات السريرية والوبائية، بتكرار الدراسة بعينة مصل مأخوذة بعد أسبوعين على الأقل، وهذا هو الحال بالضبط عندما يكون اختبار الأمصال المقترنة ضروريًا في الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية.

قد تعكس التفاعلات الإيجابية مع بروتينات gag وpol دون تفاعل مع بروتينات env الانقلاب المصلي المبكر وقد تشير أيضًا إلى الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -2 أو تفاعل غير محدد. يتم إعادة اختبار الأفراد الذين حصلوا على هذه النتائج بعد اختبار فيروس نقص المناعة البشرية -2 بعد 3 أشهر (خلال 6 أشهر).

وصف

طريقة التحديدطخة مناعية.

المواد قيد الدراسةمصل الدم

زيارة منزلية متاحة

الأجسام المضادة للنواة هي عائلة من الأجسام المضادة الذاتية التي ترتبط بالأحماض النووية الريبية والبروتينات المرتبطة بها. تحدث في أكثر من 90% من المرضى الذين يعانون من أمراض النسيج الضام المنتشرة، وغالبًا ما يتم ملاحظتها أيضًا في أمراض الكبد المناعية الذاتية وعدد من الحالات الأخرى. حتى الآن، تم تشخيص حوالي 200 نوع من هذه العائلة من الأجسام المضادة الذاتية، ولكن لا يمكن استخدام جميعها في الممارسة السريرية.

تسمح الكتلة المناعية للأجسام المضادة للنواة بدراسة 15 نوعًا رئيسيًا من الأجسام المضادة للنواة في اختبار واحد في وقت واحد، مما يضمن التشخيص التفريقي للأمراض الروماتيزمية الجهازية الرئيسية. عادة ما يتم ملاحظة كل نوع من الأجسام المضادة الذاتية التي يتم اكتشافها باستخدام اللطخة المناعية في المرضى الذين لديهم صورة سريرية مميزة، وبالتالي فإن نطاق الأجسام المضادة الذاتية لا يسمح فقط بتشخيص المرض، ولكن أيضًا لتحديد خطر الإصابة بمظاهر سريرية معينة.

يُنصح باستخدام كتلة مناعية من الأجسام المضادة للنواة في المرحلة الثانية من الفحص المصلي إذا كانت نتيجة الاختبارات الأخرى إيجابية، مما يشير إلى وجود الأجسام المضادة للنواة في مصل المريض. وتشمل هذه الاختبارات تحديد الأجسام المضادة للنواة (فحص ELISA)، والكشف عن العامل المضاد للنواة (ANF) على خلايا Hep2 ()، والأجسام المضادة للنواة والأجسام المضادة للمستضد النووي القابل للاستخراج (ENA).

تتميز طريقة التطعيم المناعي للأجسام المضادة للنواة في تشخيص الأمراض الروماتيزمية الجهازية بالخصوصية السريرية العالية. لكن خصوصية الأجسام المضادة للنواة، حتى مع وجود عيارات عالية من ANF ()، لا يمكن دائمًا تحديدها، حيث أن عددًا من مستضدات الأجسام المضادة للنواة لا تزال غير مميزة. النتيجة المناعية السلبية في هذه الحالة لا تستبعد تشخيص الأمراض الروماتيزمية الجهازية. يمكن اكتشاف عدد من الأجسام المضادة للنواة باستخدام طخة مناعية - لوحة من الأجسام المضادة الذاتية الخاصة بالتهاب العضلات () وطخة مناعية - لوحة من الأجسام المضادة الذاتية لتصلب الجلد ().

الأدب

1. لابين إس. توتوليان أ.أ. التشخيص المختبري المناعي لأمراض المناعة الذاتية / دار النشر "مان" سانت بطرسبورغ - 2010. 272 ​​​​ص.
2. ناسونوف إي.إل.، ألكسندروفا إي.إن. المعايير الحديثة للتشخيص المخبري للأمراض الروماتيزمية. التوصيات السريرية / BHM, M - 2006.
3. كونراد ك، شلوسلر دبليو، هيبي إف، فيتزلر إم جيه. الأجسام المضادة الذاتية في أمراض المناعة الذاتية الخاصة بالأعضاء: مرجع تشخيصي/ PABST، دريسدن – 2011. 300 ص.
4. كونراد ك، شلوسلر دبليو، هيبي إف، فيتزلر إم جيه. الأجسام المضادة الذاتية في أمراض المناعة الذاتية الجهازية: مرجع تشخيصي/ PABST، دريسدن – 2007. 300 ص.
5. غيرشفين إم إي، ميروني بي إل، شوينفيلد واي. الأجسام المضادة الذاتية الطبعة الثانية./ إلسفير ساينس – 2006. 862 ص.
6. Shoenfeld Y., Cervera R, Gershvin ME معايير التشخيص في أمراض المناعة الذاتية / Humana Press – 2008. 598 ص.
7. تعليمات لمجموعة الكاشف.

تحضير

يفضل الانتظار لمدة 4 ساعات بعد تناول وجبتك الأخيرة، فلا توجد متطلبات إلزامية.

مؤشرات للاستخدام

يشار إلى الاختبار للتشخيص والتشخيص التفريقي للحالات التالية:

• الذئبة الحمامية الجهازية؛
• الذئبة الجلدية تحت الحادة وأنواع أخرى من الذئبة الجلدية.
• مرض النسيج الضام المختلط.
• متلازمة سجوجرن والأمراض المرتبطة بها.
• تصلب الجلد المنتشر والموضعي، متلازمة كريست.
• اعتلال عضلي التهابي (التهاب العضلات والتهاب الجلد والعضلات) ؛
• التهاب المفاصل المزمن للأحداث.
• التهاب الكبد المناعي الذاتي
• تليف الكبد الصفراوي الأولي والتهاب الأقنية الصفراوية المصلب.
• يشار إلى استخدام هذا الاختبار عند اكتشاف عيارات عالية من العامل المضاد للنواة، والأجسام المضادة للنواة، والأجسام المضادة للمستضد النووي القابل للاستخراج، والأجسام المضادة للحمض النووي، والأجسام المضادة للجسيمات النووية، والأجسام المضادة للفوسفوليبيد.

تفسير النتائج

يحتوي تفسير نتائج البحث على معلومات للطبيب المعالج وليس تشخيصًا. لا يمكن استخدام المعلومات الواردة في هذا القسم للتشخيص الذاتي والعلاج الذاتي. يقوم الطبيب بإجراء تشخيص دقيق باستخدام نتائج هذا الفحص والمعلومات الضرورية من مصادر أخرى: التاريخ الطبي، نتائج الفحوصات الأخرى، إلخ.

وحدات القياس: اختبار نوعي، وتعرض النتيجة على شكل “مكتشف” أو “لم يتم الكشف عنه”.

عندما يتم اكتشاف نطاق يميز وجود أي نوع من الأجسام المضادة، يتم وصف شدة لون النطاق بالإضافة إلى ذلك من خلال عدد الإيجابيات ("التقاطعات") لكل نوع من أنواع الأجسام المضادة المحددة. تعكس الزيادة في درجة الإيجابية بشكل غير مباشر محتوى الأجسام المضادة الذاتية وتقاربها.

القيم المرجعية: الأجسام المضادة لـ Sm، RNP/Sm، SS-A (60 كيلو دالتون)، SS-A (52 كيلو دالتون)، SS-B، Scl-70، PM-Scl، PCNA، CENP-B، dsDNA، Histone، Nucleosome لم يتم الكشف عن Rib P، AMA-M2، Jo-1.

يتم عرض نتيجة تحديد الأجسام المضادة الذاتية في "تقاطعات" لكل مستضد مناظر. تعكس الزيادة في درجة الإيجابية المصلية بشكل غير مباشر محتوى الأجسام المضادة الذاتية وتقاربها. فيما يلي خيارات نتيجة تقييم الإيجابية المصلية:

1. لم يتم الكشف عن الأجسام المضادة.
2. +/- - نتيجة الحدود؛
3. + - محتوى منخفض من الأجسام المضادة الذاتية لمستضد معين؛
4. ++ – متوسط ​​محتوى الأجسام المضادة الذاتية لمستضد معين؛
5. +++ – نسبة عالية من الأجسام المضادة الذاتية لمستضد معين.

الأمراض الرئيسية المرتبطة باكتشاف الأجسام المضادة للنواة:

مولد المضاد	معنى
سم (سميث)	علامة محددة للذئبة الحمامية الجهازية (مدرجة في المعيار العاشر لمرض الذئبة الحمراء للكلية الأمريكية لأمراض الروماتيزم، ACR)
SS-A (Ro52)	ويلاحظ في أمراض المناعة الذاتية المختلفة، في كثير من الأحيان في الذئبة الحمامية الجهازية وأشكالها الجلدية، والأمراض الروماتيزمية الجهازية، والتهاب المفاصل الروماتويدي، وأمراض الكبد المناعية الذاتية، وما إلى ذلك.
SS-A (Ro60)	الذئبة الحمامية الجهازية، الأشكال الجلدية من الذئبة الحمامية، حساسية للضوء في الذئبة الحمامية الجهازية، ارتفاع خطر الإصابة بالذئبة الحمامية الخلقية وتلف قلب الجنين. المؤشر المصلي الرئيسي لمتلازمة سجوجرن. غالبًا ما يُلاحظ مع الأجسام المضادة لمستضد SS-A (Ro52).
إس إس-ب	متلازمة سجوجرن، الذئبة الحمامية الجهازية.
PCNA	الذئبة الحمامية الجهازية، خطر التهاب الكلية الذئبي.
الريبوسومات (ريبو ف)	الذئبة الحمامية الجهازية، خطر تلف الجهاز العصبي المركزي.
النيوكليوزومات	الذئبة الحمامية الجهازية، ارتفاع خطر الإصابة بالتهاب كبيبات الكلى الذئبة.
الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل	علامة محددة للذئبة الحمامية الجهازية (مدرجة في معيار ACR العاشر لمرض الذئبة الحمراء)، وارتفاع خطر الإصابة بالتهاب الكلية الذئبي.
سنرنب/سم	مرض النسيج الضام المختلط، الذئبة الحمامية الجهازية مع انخفاض خطر تلف الكلى، تصلب الجلد.
الهستونات	الذئبة الحمامية الجهازية، الذئبة الناجمة عن المخدرات، تصلب الجلد.
إس سي إل-70	التصلب الجهازي مع تلف منتشر في الجلد والأعضاء الداخلية.
PM-Scl	تصلب الجلد يرافقه التهاب العضلات.
سينب-ب	متلازمة كريست مع تصلب الأصابع، توسع الشعريات، التكلسات تحت الجلد، متلازمة رينود، التهاب المريء.
جو-1	التهاب العضلات في شكل متلازمة مضاد التخليق.
AMA-M2	تليف الكبد الصفراوي الأولي، متلازمة سجوجرن.

اللطخة المناعية –(من "لطخة" الإنجليزية - بقعة) - طريقة لتحديد المستضدات (أو الأجسام المضادة) باستخدام الأمصال (أو المستضدات) المعروفة. وهو عبارة عن مزيج من الرحلان الكهربائي الهلامي وELISA. في البداية، يتم تدمير الخلايا البكتيرية أو الفيروسات باستخدام الموجات فوق الصوتية، ثم يتم فصل جميع مستضدات الفيروس أو الخلايا البكتيرية عن طريق الرحلان الكهربائي ويتم الحصول على كاشف تجاري على فيلم خاص من النيتروسليلوز. عند إجراء التطعيم المناعي، يتم تطبيق مصل المريض قيد الدراسة على فيلم يحتوي على مستضدات معروفة. بعد الحضانة وغسل الأجسام المضادة غير المرتبطة، انتقل إلى ELISA - يتم تطبيق مصل مضاد للجلوبيولين المناعي البشري المسمى بإنزيم وركيزة مولدة للون يتغير لونها عند التفاعل مع الإنزيم على الفيلم. في وجود مستضد-جسم مضاد-مصل مضاد لمجمعات إنزيم الغلوبولين المناعي، تظهر بقع ملونة على الناقل. تسمح لك طريقة التطعيم المناعي بالكشف بشكل منفصل عن الأجسام المضادة لمستضدات مسببات الأمراض المختلفة (على سبيل المثال، في الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، يكتشف التطعيم المناعي الأجسام المضادة لـ gp120 وgp24 والمستضدات الفيروسية الأخرى).

المقايسة المناعية الإشعاعية (RIA)

تعتمد الطريقة على تفاعل مولد الضد مع الجسم المضاد باستخدام النويدات المشعة الموسومة بمستضد أو جسم مضاد. يتم استخدام 125I، 14C، 3H، 51Cr والنويدات المشعة الأخرى كتسميات. يتم عزل المجمعات المناعية الناتجة عن النظام ويتم تحديد نشاطها الإشعاعي على عدادات (إشعاع بيتا). تتناسب شدة الإشعاع بشكل مباشر مع عدد جزيئات المستضد والجسم المضاد المرتبطة.

إن نسخة الطور الصلب من RIA التي تستخدم الأجسام المضادة الموسومة أو المستضدات الممتصة في آبار ألواح البوليسترين منتشرة على نطاق واسع.

يستخدم RIA للكشف عن مستضدات الميكروبات والفيروسات والهرمونات المختلفة والإنزيمات والأدوية والجلوبيولين المناعي، بالإضافة إلى المواد الأخرى الموجودة في مادة الاختبار بتركيزات بسيطة تبلغ 10-12-10-15 جم / لتر.

أسئلة التحكم

رد فعل التحلل الجرثومي المناعي: ما هو نوع التفاعل؟ ما هو المستضد، ما هو الجسم المضاد، آلية التفاعل، طرق الإنتاج، التطبيق العملي. رد فعل انحلال الدم المناعي: المكونات اللازمة، الإجراء . الضوابط والتطبيق العملي. تفاعل انحلال الدم الموضعي في هلام (تفاعل جيرني): مبدأ التفاعل، طريقة الصياغة، التطبيق العملي. رد فعل التثبيت المكمل: مبدأ التفاعل؛ ما يتشكل عندما يتفاعل المصل المناعي مع مستضد معين؛ ماذا يحدث للمكمل إذا كان موجودا خلال هذا التفاعل؟ ما هو مصير المتمم إذا لم يكن هناك ألفة محددة بين المستضد والأجسام المضادة؟ ما هو رد الفعل الذي يمكن استخدامه لتحديد ما حدث للمكمل؟ لماذا يتم استخدام هذا التفاعل بالذات؟ ما هي النتيجة الإيجابية المرئية لـ RSC؟ لماذا؟ ما خاصية المتممة المستخدمة في المرحلة الأولى من RSC؟ في المرحلة الثانية؟ إذا كانت النتيجة النهائية لـ RSC هي انحلال الدم، فهل يعني ذلك نتيجة إيجابية أم سلبية؟ اشرح النتائج: RSK+ + + +، RSK+ + +، RSK+ +، RSK+. قم بتسمية مكونات نظام RSK الأول ومكونات نظام RSK الثاني. لماذا يجب تعطيل مصل الاختبار؟ كيف تتم معايرة المكمل؟ المصل الانحلالي: ماذا يحتوي وكيف يتم الحصول عليه وما هو العيار وكيف يتم تحديده؟ ما هي الحيوانات المستخدمة للحصول على مكونات RSC؟ منهجية إعداد RSC في البرد. عند تنظيم أي من التفاعلات التالية يتطلب مشاركة المكمل: هطول الأمطار، التلبد، التراص، الكشف عن الأجسام المضادة غير المكتملة، التحلل الجرثومي المناعي، انحلال الدم المناعي، Jerne، RSC؟ تفاعل التألق المناعي (RIF) - يشير إلى تسلسل الأحداث في تفاعل كونز المباشر؛ المكونات الضرورية. ما هو المستضد، ما هو الجسم المضاد، ما هي الأجسام المضادة الموسومة، كيف يتم أخذ نتيجة التفاعل في الاعتبار، كيف تبدو النتيجة الإيجابية؟ التطبيق العملي - ما الذي يمكن تحديده باستخدام هذا التفاعل؟ تفاعل التألق المناعي غير المباشر - يشير إلى تسلسل الأحداث خلال هذا التفاعل، والمكونات الضرورية، وما هو المستضد، وما هي الأمصال المناعية المستخدمة؛ الاستخدام العملي؛ الاستفادة من RIF غير المباشر مقارنة برد الفعل المباشر. مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) - مبدأ التفاعل؛ المكونات الضرورية الإشارة إلى تسلسل الأحداث عند إجراء تفاعل للكشف عن المستضد في المادة التي يتم اختبارها؛ المكونات الضرورية ماذا يحدث عندما تكون النتيجة إيجابية، كيف تبدو؟ الإشارة إلى تسلسل الإجراءات عند إجراء ELISA للكشف عن الأجسام المضادة في مصل الاختبار؛ المكونات الضرورية ماذا يحدث إذا كانت النتيجة إيجابية؟ اللطخة المناعية – مبدأ التفاعل؛ المراحل الرئيسية؛ المكونات الضرورية كيف يتم أخذ النتيجة بعين الاعتبار؛ فوائد رد الفعل. المقايسة المناعية الإشعاعية (RIA) - ما هي المراحل الرئيسية للتفاعل؟ ما هي الأجسام المضادة أو المستضدات الموسومة، وكيف يتم أخذ النتيجة بعين الاعتبار؟ المجهر الإلكتروني المناعي - مبدأ الطريقة؛ المراحل الرئيسية؛ المكونات الضرورية ما هي الأجسام المضادة المسمى؟ كيف يتم أخذ نتيجة التفاعل في الاعتبار. تفاعلات التثبيت – مبدأ الطريقة، تقنية الإعداد، المكونات، تسجيل النتائج.

المهام التي يجب إكمالها أثناء عملية الدراسة الذاتية.

املأ جدول "التفاعلات المناعية" فيما يتعلق بالتفاعلات التي تمت مناقشتها في هذا الموضوع.

ردود الفعل المناعية

عمل الطالب أثناء الدرس العملي

ابدأ العمل فورًا بإعداد المرحلة الأولى من RSK، ولكن دون ذلك في دفتر ملاحظاتك لاحقًا (انظر أدناه).

1. تفاعل انحلال الدم المناعي. عرض تفاعل توضيحي لانحلال الدم المناعي، ورسمه على شكل رسم تخطيطي، وشرح النتيجة في الأنابيب التجريبية والضابطة.

2. رد فعل التثبيت المكمل

أ) تحليل RSK وفقا للجدول؛

ب) ارسم في دفتر ملاحظات رسمًا تخطيطيًا لإعداد RSC على شكل جدول؛

ج) وضع المرحلة الثانية من RSK (يتم وضع المرحلة الأولى في بداية الدرس)؛

د) تحليل الاستعدادات التشخيصية اللازمة لـ RSC؛

د) تأخذ في الاعتبار النتيجة. قم بصياغة استنتاج حول وجود أجسام مضادة محددة في مصل الاختبار.

3. رد فعل المناعي. ادرس الجدول، وقم بعمل رسم تخطيطي للتفاعل في دفتر ملاحظاتك؛ انظر إلى الأمصال التشخيصية؛ تحديد ما يحتوي عليه المصل، وكيفية تحضيره، ولأي تفاعل (مباشر أو غير مباشر) يتم استخدامه. انظر إلى نتيجة العرض التوضيحي لـ RIF في مجهر فلوري.

4. مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). في دفتر ملاحظاتك، قم بوضع مخطط لإعداد التفاعل في نسختين: للكشف عن المستضد في المادة قيد الدراسة وللكشف عن الأجسام المضادة في المصل. قم بمراجعة مجموعة مكونات فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد الوبائي (ب) وحدد ما يحتوي عليه كل مكون والغرض من استخدامه.

5. اللطخة المناعية. قم بعمل رسم تخطيطي للتفاعل في دفتر ملاحظاتك؛ شاهد المظاهرة - نتيجة رد الفعل.

6. المقايسة المناعية الإشعاعية (RIA). قم بعمل رسم تخطيطي للتفاعل في دفتر الملاحظات الخاص بك.

7. المجهر الإلكتروني المناعي (IEM). شاهد العرض التوضيحي - نتيجة التفاعل، ارسم مخططًا للتفاعل في دفتر ملاحظاتك، وأشر بالأسهم إلى المستضد (الفيروس) والأجسام المضادة المميزة.

اللطخة المناعية هي طريقة حساسة للغاية للكشف عن البروتينات، تعتمد على مزيج من الرحلان الكهربائي وELISA أو RIA. يتم استخدام اللطخة المناعية كوسيلة لتشخيص الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، وما إلى ذلك.

بشكل عام، يشير النشاف المناعي إلى تحليل خليط من البروتينات المنقولة إلى دعامة غشائية صلبة، والتي ترتبط بها بروابط تساهمية، يليها الكشف المناعي.

يمكنك تحليل خليط من البروتينات المطبقة مباشرة على الركيزة - تحليل اللطخة النقطية - أو بعد تجزئةها الأولية عن طريق التركيز الكهربائي، أو الرحلان الكهربي للقرص أو الرحلان الكهربي ثنائي الأبعاد - تحليل اللطخة الغربية.

يتم فصل مستضدات مسببات الأمراض باستخدام الفصل الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد، ثم يتم نقلها من الهلام إلى الورق المنشط أو غشاء النيتروسليلوز وتطويرها باستخدام ELISA.

تنتج الشركات مثل هذه الشرائط مع "بقع" من المستضدات. يتم وضع مصل المريض على هذه الشرائط. . بعد ذلك، بعد الحضانة، يتم غسل المريض من الأجسام المضادة غير المرتبطة ويتم تطبيق مصل ضد الغلوبولين المناعي البشري الموسوم بالإنزيم . يتم الكشف عن المجمع المتكون على الشريط (المستضد + الجسم المضاد للمريض + الجسم المضاد ضد Ig البشري) عن طريق إضافة ركيزة مولدة للضوء والتي تغير لونها تحت تأثير الإنزيم.

تُستخدم هذه المنهجية أيضًا لاختيار مستنسخات من البكتيريا أو العاثيات أو الفيروسات التي تعبر عن منتجات الجينات المستنسخة المستهدفة.

يتم نقل البروتينات إلى الغشاء إما بشكل سلبي أو باستخدام معدات النقل الكهربائي. تتأثر كفاءة نقل البروتين إلى الغشاء بعدة عوامل، مثل الوزن الجزيئي للبروتينات، ومسامية الهلام، ووقت النقل، وتكوين المحلول المنظم (العازل العابر) المستخدم.

اعتمادا على أهداف وشروط التجربة، يتم اختيار شروط النقل التي توفر أفضل النتائج. يشيع استخدام النيتروسليلوز أو البولي فينيلدين ثنائي فلوريد (PVDF) أو أغشية النايلون المشحونة إيجابياً كركائز. يمكن أن يرتبط النيتروسليلوز بما يصل إلى 80 - 100 ميكروجرام من البروتين لكل 1 سم2.

يمكن فقدان البروتينات ذات الوزن الجزيئي المنخفض (ذات الوزن الجزيئي أقل من 20 كيلو دالتون) نتيجة لعمليات الغسيل، وهذا يجعل من الممكن إجراء دراسة أولية لتعدد الأشكال في بعض المواقع الجينية بناءً على أطوال أجزاء تقييد الحمض النووي المقابلة.

بالإضافة إلى ذلك، باستخدام التهجين الجنوبي، يمكنك بسهولة معرفة ما إذا كان الجين المستهدف يحتوي على موقع للتحلل المائي بواسطة إنزيم تقييد معين في الجزء الداخلي منه، مما يسمح لك باختيار الإستراتيجية المثلى لاستنساخ منطقة الجينوم المدروسة.

باستخدام مخطط مماثل، يمكن نقل جزيئات الحمض النووي الريبي (RNA) من هلام الاغاروز إلى مرشح النيتروسليلوز. سُميت هذه الطريقة بالنشاف الشمالي، على عكس النشاف الجنوبي، لأن اسم Southern يعني "جنوبي" باللغة الإنجليزية.

وبالتالي فإن نقل البروتينات إلى المرشحات من الجل كان يسمى بالنشاف الغربي. قد يتم نقل البروتينات الكبيرة (> 100 كيلو دالتون) المشوهة في محلول كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) بشكل سيئ إلى الغشاء في حالة وجود الإيثانول في المخزن المؤقت العابر. يحسن الكحول بشكل كبير نقل البروتينات من هلام بولي أكريلاميد SDS، ولكنه يضيق المسام في الجل، مما يؤدي إلى الاحتفاظ بالبروتينات الكبيرة.

تم تحسين غشاء PVDF للكشف المناعي وهو قادر على الاحتفاظ بما يصل إلى 160 ميكروجرام/سم2 من البروتينات المرتبطة بشكل خاص مع مستويات منخفضة جدًا من الارتباط غير المحدد.

اللطخة المناعية

من الخصائص المهمة لهذا الغشاء إمكانية استخدامه المتكرر. تعمل أغشية النايلون Zeta-Probe على ربط بروتينات SDS بشكل فعال في غياب الكحول، وهذا الارتباط مقاوم للعلاجات اللاحقة. يتم أيضًا الاحتفاظ بالبروتينات ذات الوزن الجزيئي المنخفض بشكل فعال. بفضل قدرة الارتباط العالية التي تبلغ حوالي 480 ميكروغرام من البروتين لكل سم2، تتيح أغشية Zeta-Probe اكتشاف كميات ضئيلة من البروتين في مخاليط الاختبار.

بمجرد تثبيت المستضد على الغشاء، يتم إغلاق مواقع الارتباط المتبقية بمحلول الجيلاتين أو ألبومين المصل البقري أو الحليب الخالي من الدسم.

ثم يتم تحضين الغشاء في محلول من الأجسام المضادة متعددة النسيلة أو وحيدة النسيلة للمستضد قيد الدراسة. بعد غسل الأجسام المضادة غير المرتبطة، يتم تحضين الغشاء في محلول من الأجسام المضادة الثانوية، وهي عبارة عن اتحاد إنزيمات الفوسفاتيز القلوي (AP) أو بيروكسيداز الفجل الحار (HRP) مع الأجسام المضادة للأنواع (الأجسام المضادة للماعز للأرانب أو الفأر أو الجلوبيولين المناعي البشري). ) أو البروتينات A (بروتين المكورات العنقودية الذهبية) أو G (بروتين المكورات العقدية sp.)، ذات درجة تقارب عالية لمنطقة Fc من الغلوبولين المناعي.

يتم الكشف عن المجمعات المناعية المشكلة كيميائيا أو كيميائيا. ركائز التفاعل الكيميائي عند استخدام اتحادات الفوسفاتيز القلوية هي 5-برومو-4-كلورو-3-إيندوليل فوسفات (BCIP) أو التترازوليوم الأزرق (NBT)، وعند استخدام اتحادات بيروكسيداز الفجل - 4-كلورو-1-نفثول وبيروكسيد الهيدروجين .

نتيجة للتفاعلات الأنزيمية، يتم تشكيل شريط ملون أو بقعة على الغشاء في موقع توطين مجمع الأجسام المضادة للمستضد.

حساسية هذه الطريقة هي 100 بيكوغرام من البروتين عند استخدام اتحادات AP و100-500 بيكوغرام عند استخدام اتحادات HRP. يسمح الكشف الكيميائي للمجمعات المناعية باكتشاف أقل من 5 بيكوغرام من المستضد. مبدأ هذه الطريقة هو أنه عندما يتفاعل HRP مع بيروكسيد الهيدروجين وثنائي أسيل هيدرازين لومينول الحلقي، ينبعث الضوء عند طول موجي قدره 428 نانومتر، والذي يمكن تسجيله على فيلم حساس للضوء.

تم تطوير تفاعل التطعيم المناعي (IB) على أساس ELISA. إنها الطريقة الأكثر تحديدًا وحساسية للتحليل الكيميائي المناعي. يجمع التطعيم المناعي (من اللطخة الإنجليزية - لطخة، وصمة عار) بين ELISA والرحلان الكهربائي. يتم استخدامه للكشف عن الأجسام المضادة غير المعقدة لفيروس نقص المناعة البشرية، ولكن الأجسام المضادة لبروتيناته الهيكلية الفردية (البروتينات p24، البروتينات السكرية gp120، gp 41، وما إلى ذلك). يشير إلى ردود أفعال الخبراء (المؤكدة) لتشخيص الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية.

يتم التفاعل على عدة مراحل:

يتم تدمير الفيروس إلى مكونات - المستضدات (p24، gp120، gp 41، وما إلى ذلك)، والتي تخضع للرحلان الكهربائي في هلام بولي أكريلاميد، أي فصل المستضدات إلى أجزاء حسب الوزن الجزيئي.

2. يتم تغطية الجل بغشاء من النيتروسليلوز ويتم نقل أجزاء المستضد إليه باستخدام الرحلان الكهربائي. يتصرف النيتروسليلوز مثل الورق النشاف. يتم قطع الغشاء إلى شرائح. تنتج الشركات مثل هذه الشرائط مع "بقع" من المستضدات.

Immunoblotting - طريقة إضافية غير مباشرة

يتم غمر الشرائط المغلفة بمستضدات فيروس نقص المناعة البشرية في مصل الشخص ثم يتم غسلها لإزالة المواد غير المرتبطة.

4. يتم تحضين الشرائط بمصل مضاد الجلوبيولين الموسوم بالبيروكسيداز وغسلها.

تتم إضافة الركيزة ويتم ملاحظة عدد الكسور الملونة (البقع) التي تتوافق مع منطقة التوطين لمجمع AG-AT.

يؤكد وجود العصابات في مناطق معينة من الشريط وجود أجسام مضادة لمستضدات فيروس نقص المناعة البشرية المحددة بدقة في المصل الذي تم اختباره. تعتبر نتيجة النشاف المناعي إيجابية إذا كانت النطاقات المقابلة لأي اثنين من مستضدات فيروس نقص المناعة البشرية الثلاثة - p24 و gp41 و gp 120 مرئية على الغشاء (الشكل 37).

الرسومات

قائمة المراجع المستخدمة

الأدب الرئيسي

علم الأحياء الدقيقة الطبية وعلم الفيروسات والمناعة: كتاب مدرسي لطلاب الطب. الجامعات الطبعة الثانية، مراجعة. وإضافية — 702 ص. إد. أ.أ. فوروبيوفا. م: متحف الفن الإسلامي، 2012.

2. علم الأحياء الدقيقة وعلم الفيروسات والمناعة: دليل لفصول المختبر: كتاب مدرسي/(V.B. Sboychakov وآخرون)؛ حررت بواسطة V. B. سبويشاكوفا، م. – م: جيوتار-ميديا، 2014.- 320 ص: غير ذلك.

3. علم الأحياء الدقيقة الطبية والمناعة وعلم الفيروسات [مصدر إلكتروني]: كتاب مدرسي عن العسل.

الجامعات - 760 ص. — وضع الوصول: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. سانت بطرسبرغ: سبيتسليت، 2010.

4. علم الأحياء الدقيقة الطبية وعلم الفيروسات والمناعة [مصدر إلكتروني]: كتاب مدرسي: في مجلدين / المجلد 1. - 448 ص. - وضع الوصول: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V.، Boychenko M.N.

م: جيوتار ميديا، 2010. .

5. علم الأحياء الدقيقة الطبية وعلم الفيروسات والمناعة [المصدر الإلكتروني]: كتاب مدرسي: في مجلدين T. 2. - 480 ص. وضع الوصول: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V.، Boychenko M.N. م: جيوتار ميديا، 2010.

الأدب الإضافي

1. التفاعلات التشخيصية المناعية: كتاب مدرسي / شركات: G.K.Davletshina، Z.G.Gabidullin، A.A.Akhtarieva، M.M.Tuigunov، A.K.Bulgakov، T.A.Savchenko، R.F.

Khusnarizanova، Yu.Z. Gabidullin، M. M. Alsynbaev - أوفا: دار النشر التابعة لمؤسسة الموازنة التعليمية الحكومية للتعليم المهني العالي BSMU التابعة لوزارة الصحة الروسية، 2016. - 86 ص.

2. ميزات بعض الخصائص التي تحدد القدرة المسببة للأمراض للاختلافات المزروعة في البكتيريا Enterobacter، Citrobacter، Serratia، E.coli، Proteus: منشور علمي / Yu. Z. Gabidullin، R. S. Sufiyarov، I. I. Dolgushin - Ufa، 2015. - 250 ثانية.

الصفحة الرئيسية » الكتلة المناعية – ما هو؟ اللطخة المناعية في تشخيص الأمراض المعدية

الكتلة المناعية - ما هو؟ اللطخة المناعية في تشخيص الأمراض المعدية

ما هي الطخة المناعية؟ هذه طريقة شائعة للتشخيص المختبري للعدوى الفيروسية البشرية. إنها واحدة من أكثر الطرق دقة وموثوقية للكشف عن وجود فيروس نقص المناعة البشرية.

ومن حيث الموثوقية، فهو أكبر من مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (إليزا). تعتبر نتائج Immunoblot حاسمة وحاسمة

الكتلة المناعية - ما هو؟ من أجل التعرف على إصابة الشخص بفيروس نقص المناعة البشرية، يجب عليك الخضوع لفحص معملي لفحص مصل الدم لديك بحثًا عن وجود الأجسام المضادة.

تسمى أقسام اللطخة الغربية أيضًا بالبقع الغربية. يتم استخدامه للكشف عن الالتهابات الفيروسية البشرية كطريقة احترافية إضافية. يعد ذلك ضروريًا لتأكيد ELISA - وهو اختبار معملي يسمح لك بتحديد وجود الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية في الدم. إعادة فحص Immunoblot إيجابي ELISA.

ويعتبر الأكثر حساسية وتعقيدا ومكلفة.

هدف

ما هي الطخة المناعية؟ تقوم هذه الطريقة بإجراء فحص مختبري لمصل الدم لوجود الأجسام المضادة للفيروس.

خلال دراسات خاصة، تم العثور على إجمالي البروتينات الفيروسية في الجل وعلى أغشية النيتروسليلوز.

اللطخة المناعية (الكشف عن الأجسام المضادة في أمصال المريض لبعض مستضدات مسببات الأمراض)

يهدف إجراء قسم اللطخة الغربية إلى تحديد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية في مراحل مختلفة. في المرحلة الأولى، يتم إخضاع الفيروس المنقى من الأجزاء المكونة له للرحلان الكهربائي ويتم تقسيم المستضدات الموجودة فيه حسب الوزن الجزيئي.

يتكاثر فيروس نقص المناعة البشرية في الخلايا الحية المدمجة في معلوماته الوراثية. في هذه المرحلة، يصبح الشخص حاملاً لفيروس نقص المناعة البشرية إذا كنت مصاباً به.

خصوصية هذا المرض هو أنه لا يظهر نفسه لفترة طويلة. ويدمر الفيروس الخلايا الليمفاوية، وبالتالي تنخفض مناعة الإنسان ويصبح الجسم غير قادر على مقاومة العدوى.

إذا تم علاج فيروس نقص المناعة البشرية بشكل صحيح وسريع، فسوف يعيش المريض حتى سن الشيخوخة. عدم العلاج يؤدي حتما إلى الموت. ومن لحظة الإصابة ولكن بدون علاج فإن المدة القصوى لا تزيد عن عشر سنوات.

الخصائص

يعد تحليل Immunoblot طريقة موثوقة تسمح لك بتحديد وجود الأجسام المضادة لمستضدات فيروس نقص المناعة البشرية من النوعين الأول والثاني.

إذا أصيب شخص ما، فقد يتم اكتشاف الأجسام المضادة بعد أسبوعين في وقت لاحق. ومن السمات الخاصة لفيروس نقص المناعة البشرية أن كمية الأجسام المضادة تتزايد بسرعة وتبقى في دم المريض. وحتى لو كانت موجودة، فقد لا يظهر المرض لمدة عامين أو أكثر. لا تشير طريقة ELISA دائمًا بدقة إلى وجود المرض، مما يتطلب تأكيد النتائج من PCR ومقاطع اللطخة الغربية إذا أظهر الاختبار المناعي الإنزيمي نتيجة إيجابية.

مؤشرات ل

ما هو نوع "البقعة المناعية" التي تم اكتشافها بالفعل، ولكن ما هي تلك التي يتم تقديمها في الدراسة؟

سيكون سبب اختبار فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) هو نتيجة ELISA إيجابية. من الضروري الخضوع لفحص الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم لدى المرضى الذين هم على وشك الخضوع لعملية جراحية. بالإضافة إلى ذلك، يجب عليك إجراء تحليل للنساء اللاتي يخططن للحمل، وكذلك أولئك الذين هم غير شرعيين. توصف أقسام اللطخة الغربية للمرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية إذا كانت نتائج إليسا ملتبسة.

قد تكون الأعراض المزعجة التالية سببا في الاتصال بالطبيب: فقدان الوزن السريع، ضعف، اضطرابات الأمعاء (الإسهال)، والتي تستمر لمدة ثلاثة أسابيع؛ تضخم الغدد الليمفاوية في الجسم ، الالتهاب الرئوي، داء المقوسات، تفاقم الهربس.

لا يحتاج المريض إلى الاستعداد قبل التبرع بالدم الوريدي.

لا تأكل قبل 8-10 ساعات من الاختبار. في اليوم السابق للتبرع بالدم، لا يُنصح بشرب الكحول أو مشروبات القهوة أو ممارسة التمارين البدنية الثقيلة أو الشعور بالقلق.

أين يتم إجراء التحليل؟

أين يمكنني إجراء اختبار فيروس نقص المناعة البشرية؟

ELISA، تحليل اللطخة المناعية، الذي يتم إجراؤه في العيادات الخاصة بالمدينة، يعطي نتائج خلال يوم واحد. التشخيص العاجل ممكن أيضا. في المؤسسات العامة، الاختبارات الطبية إليسا وأقسام اللطخة الغربية مجانية، وفقًا لتشريعات الاتحاد الروسي.

الفحص الإلزامي للأمراض المعدية لدى النساء الحوامل والمرضى الذين يحتاجون إلى دخول المستشفى أو الجراحة. كيف يتم إجراء هذا الاختبار؟

كيفية إجراء إليسا؟ Immunoblot إيجابية / سلبية تؤكد أو تدحض نتائج إليسا. الاجراء سهل للغاية. يقوم الأخصائي بجمع الدم الوريدي، وهو ما يستغرق أقل من خمس دقائق.

بعد أخذ العينة، يجب تطهير موقع الحقن وتغطيته بضمادة. يتم إجراء أخذ العينات على معدة فارغة، لذلك بعد الإجراء لن يضر تناول قطعة من الشوكولاتة الداكنة أو مشروب ساخن حلو.

للحصول على تحويلة لإجراء فحص مجاني في مؤسسة طبية عامة، يجب عليك زيارة الطبيب المعالج.

بشكل عام، لا تختلف البقعة المناعية عن اختبارات الدم الأخرى من خلال جمعها. منهجية البحث بسيطة. في حالة وجود فيروس في دم الشخص، يبدأ الجسم في إنتاج أجسام مضادة لتدميره. لكل فيروس هناك العديد من المستضدات البروتينية. الكشف عن هذه الأجسام المضادة هو أساس طريقة قسم اللطخة الغربية. سعر

كم مدة التحليل؟ يعد اختبار المناعة المناعية لفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) أحد أرخص الاختبارات.

في المتوسط، تتراوح طرق الفحص المناعي من 500 إلى 900 روبل. أقسام اللطخة الغربية هي دراسة الاختبارات التي تتراوح تكلفتها من ثلاثة إلى خمسة آلاف روبل. الأساليب الأكثر تعقيدًا هي أكثر تكلفة بكثير. على سبيل المثال، لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، سوف تحتاج إلى دفع حوالي 12000 روبل.

تفسير النتائج

الطرق الأكثر شيوعًا لتشخيص الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية هي مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم واللطخة المناعية.

يتم استخدامها لتحديد الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية في المصل. عادة ما يتم تأكيد الإصابة عن طريق اختبارين: الفحص والتأكيد. يجب أن يتم تفسير النتائج من قبل الطبيب الذي يقوم بالتشخيص ووصف العلاج. إذا كانت البقعة المناعية إيجابية، فهذا يعني وجود فيروس في جسم الإنسان.

لا ينبغي أن تكون النتيجة الإيجابية سببا للعلاج المستقل، حيث قد يكون لكل مريض صورته الخاصة للمرض.

يشمل التحليل النوعي الفحص وإصدار الشهادات. وإذا لم يتم اكتشاف الفيروس لدى المريض تكون النتيجة “سلبية”. عندما يتم الكشف عن هذه الشهادة، يتم إجراء دراسات فحص إضافية. تحليل المناعي، الذي يؤكد أو يدحض الفحص. إذا ظهرت شرائط الاختبار في مناطق مظلمة معينة (توضع البروتينات)، يتم تشخيص الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية.

إذا كانت النتائج مشكوك فيها، يتم إجراء الاختبارات خلال ثلاثة أشهر.

من الممكن الوقاية من الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية إذا اتبعت قواعد معينة: تجنب الاتصال الجنسي العرضي، واستخدام الواقي الذكري أثناء الاتصال، وعدم استخدام المخدرات.

إذا تم اكتشاف المرض لدى المرأة الحامل فمن المهم اتباع توصيات الطبيب المعالج ولا تنس إجراء اختبار وجود الفيروس.

ما هو النشاف الغربي؟

يعد تحديد البروتين في المخاليط المعقدة أو المستخلصات من الأنسجة المختلفة أحد المشكلات التي يتم مواجهتها بشكل متكرر. وباستخدام أداة مثل الأجسام المضادة المحددة، من الممكن تحديد البروتين قيد الدراسة بأقل وقت وتكاليف مالية.

في طريقة النشاف الغربي، في المرحلة الأولى، يتم فصل خليط البروتينات عن طريق الرحلان الكهربائي في وجود كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)، ثم يتم نقله إلى غشاء النيتروسليلوز عن طريق النشاف الكهربائي.

جوهر هذه الطريقة هو أنه بعد الرحلان الكهربائي، يتم وضع الجل على غشاء النيتروسليلوز بين طبقات ورق الترشيح. يتم وضع "الساندويتش" المجمع بهذه الطريقة في مجال كهربائي بحيث تتحرك مجمعات البروتين SDS عبر الصفيحة الهلامية ويتم تثبيتها (نتيجة لامتصاص غير محدد) على سطح غشاء النيتروسليلوز.

يرتبط ارتباط مركب البروتين-SDS بغشاء النيتروسليلوز بشكل أساسي بقوى ذات طبيعة كهربائية، وهذا التفاعل متعدد النقاط ويؤدي إلى "انتشار" البروتينات على سطح الغشاء. وهكذا، بعد النقل الكهربائي، نحصل على نسخة طبق الأصل من هلام على النيتروسليلوز مع البروتينات الموجودة بنفس الطريقة كما هو الحال في هلام بولي أكريلاميد.

بعد الرحلان الكهربي SDS، والنقل الكهربي وامتصاص البروتينات من الجل إلى غشاء النيتروسليلوز، يتغير الشكل الثالث للبروتين بشكل كبير، إذا كان من الصحيح عمومًا الحديث عن وجود بنية ثلاثية للبروتين بعد هذه المعالجة القاسية. ولذلك، للكشف الكيميائي المناعي للبروتين قيد الدراسة، عادة ما يتم استخدام فقط الأجسام المضادة أحادية أو متعددة النسيلة الخاصة بالمناطق الخطية لجزيء البروتين.

51. المقايسة المناعية الإنزيمية، اللطخة المناعية. الآلية والمكونات والتطبيق.

الأجسام المضادة الخاصة بالحواتم المطابقة (أو المناطق التي تتضمن اتصالات بين الوحدات الفرعية) ليست مناسبة للاستخدام في النشاف الغربي بشكل عام.

بعد نقل البروتين، يتم تحضين الغشاء بالتتابع بأجسام مضادة خاصة بالبروتين قيد الدراسة، ثم بأجسام مضادة ثانوية خاصة بأجزاء Fc من الأجسام المضادة الأولية، مترافقة مع ملصق إنزيم (أو أي نوع آخر) (الشكل 1).

1 أ). في الحالة التي تكون فيها الأجسام المضادة الأولية الخاصة بالمستضد قيد الدراسة مرتبطة مباشرة بالملصق، فإن الأجسام المضادة الثانوية ليست مطلوبة (الشكل 1 ب). يتم "تجلى" المجمعات المناعية المتكونة في موقع توطين البروتين قيد الدراسة باستخدام ركيزة مولدة للضوء (اعتمادًا على نوع الملصق).

تعتمد حساسية وخصوصية الطريقة بشكل كبير على الأجسام المضادة المستخدمة في البحث.

يجب أن تكون الأجسام المضادة المستخدمة خاصة بتسلسل حمض أميني فريد مميز فقط للبروتين الذي تتم دراسته. وبخلاف ذلك، من الممكن تفاعل (خاصة في حالة مستخلصات البروتين الخام) للأجسام المضادة مع العديد من جزيئات البروتين، الأمر الذي سيؤدي بدوره إلى ظهور عدة أشرطة ملونة على الغشاء.

غالباً ما يكون تحديد البروتين قيد الدراسة في هذه الحالة صعباً أو حتى مستحيلاً.

العامل المهم الثاني الذي يجب أخذه في الاعتبار عند اختيار الأجسام المضادة هو التقارب. كلما زاد تقارب الأجسام المضادة المستخدمة، كلما كانت نطاقات البروتين أكثر إشراقًا ووضوحًا، وكلما زادت حساسية الطريقة. عند استخدام الأجسام المضادة عالية الألفة، يمكن تحقيق حساسية تبلغ 1 نانوجرام أو أعلى.

لتصور نتيجة التفاعل بين المستضد المرتبط بالغشاء والأجسام المضادة، يتم استخدام الأجسام المضادة الثانوية، مترافقة مع عوامل قادرة على إنتاج إشارة معينة في ظل ظروف معينة.

عادة، يتم استخدام إنزيم (بيروكسيداز أو فوسفاتيز) كعامل، حيث يكون منتج التفاعل ملونًا ويترسب على الغشاء في شكل راسب غير قابل للذوبان.

من الممكن أيضًا استخدام ملصقات الفلورسنت بهذه الطريقة.

أرز. 1. مخطط التلوين الكيميائي المناعي للبروتين قيد الدراسة: أ - استخدام الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بملصق الإنزيم؛ ب - يرتبط الجسم المضاد الأولي مباشرة بعلامة إنزيمية.

بروتوكول:

I. تحضير الجل والغشاء والنقل الكهربائي للبروتين

بعد الكهربائي، يتم وضع هلام بولي أكريلاميد في الحمام مع النشاف العازلة (25 ملم تريس، ودرجة الحموضة 8.3، 192 ملم جليكاين، 10٪ إيثانول).

يتم وضع ورقتين من ورق الترشيح، مقطعتين على شكل شريط النشاف ومرطبتين بمحلول نشاف، على جزء الكاسيت الذي سيواجه الأنود. ثم يتم وضع غشاء النيتروسليلوز المبلل مسبقًا بنفس المخزن المؤقت على ورق الترشيح، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء بين الغشاء والورق.

يجب بعد ذلك وضع الجل بعناية على الغشاء، مع إيلاء اهتمام خاص مرة أخرى لضمان عدم وجود فقاعات هواء بين الجل والغشاء. يتم الانتهاء من تشكيل الساندويتش بواسطة طبقتين من ورق الترشيح المبلل، والتي يتم وضعها على سطح الجل (الشكل 2). يتم تثبيت الساندويتش الناتج في كاسيت ووضعه بين الأقطاب الكهربائية بحيث يواجه الغشاء القطب الموجب.

أرز. 2. مخطط النقل الكهربائي للبروتينات إلى الغشاء.

ثانيا. نقل كهربائي

يتم إجراء النقل الكهربائي للبروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز في مخزن مؤقت يحتوي على 25 ملي مولار تريس، درجة الحموضة 8.3، 192 ملي مولار جليكاين، 10٪ إيثانول لمدة 30-50 دقيقة عند جهد ثابت قدره 100 فولت.

يعتمد وقت النقل الكهربائي على حجم البروتينات التي يتم نقلها؛ فكلما زاد حجم البروتين، كلما استغرق النقل الكهربائي وقتًا أطول. يتم تقييم جودة النقل الكهربي وموقع نطاقات البروتين عن طريق تلوين غشاء النيتروسليلوز بمحلول 0.3% من Ponceau S في 1% من حمض الأسيتيك. قبل التلوين الكيميائي المناعي، يجب غسل الغشاء عدة مرات بمحلول تريس مائي ضعيف القلوية لإزالة الصبغة المرتبطة بالبروتينات.

ثالثا. تلطيخ المناعي الكيميائي للبروتينات المجمدة على غشاء النيتروسليلوز

لمنع مواقع ربط الأجسام المضادة غير المحددة، يتم تحضين الغشاء مع التحريك المستمر في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في PBST (لحجب أفضل، يمكن استخدام محلول PBST يحتوي على 10٪ من مسحوق الحليب الخالي من الدسم).

بعد الحجب، يتم تحضين الغشاء لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة مع التحريك المستمر في PBST الذي يحتوي على 1-10 ميكروجرام/مل من الأجسام المضادة المحددة.

يتم تحديد التركيز الأمثل للأجسام المضادة تجريبيًا ويعتمد على تقارب تفاعل الأجسام المضادة مع المستضد.

في نهاية الحضانة، اغسل الغشاء 5 مرات باستخدام PBST ونقله إلى محلول من الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة ببيروكسيداز الفجل. عادةً ما تتم الإشارة إلى تخفيف المترافق من قبل الشركة المصنعة على العبوة، أو يتم اختياره تجريبيًا بواسطة الباحث. احتضان الغشاء في محلول الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة مع التحريك المستمر.

بعد الغسيل الشامل (تغيير المخزن المؤقت 5-6 مرات على الأقل)، يتم نقل غشاء PBST إلى محلول ركيزة ملون يحتوي على 3 ملغ من ثنائي أمينوبنزيدين (DAB) و10 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين 30٪ في 10 مل من 0.1 مولار تريس-حمض الهيدروكلوريك. ، الرقم الهيدروجيني 7.6.

تتم الحضانة مع التحريك لمدة 5 - 10 دقائق. بعد اكتمال الحضانة مع الركيزة، يجب غسل الغشاء باستخدام PBST، وتجفيفه عن طريق النشاف باستخدام ورق الترشيح، ويجب عمل نسخة إلكترونية على الفور عن طريق المسح الضوئي بالألوان. إذا جف الغشاء تمامًا، فإن خطوط البروتين المطلية تتلاشى وتبدو الصورة أقل سطوعًا وتباينًا.

ملاحظة: DAB مادة سامة ومسرطنة محتملة. العمل فقط بالقفازات المطاطية!

اللطخة المناعية (اللطخة المناعية) هي طريقة مرجعية محددة للغاية وحساسة للغاية تؤكد تشخيص المرضى الذين حصلوا على نتائج اختبار إيجابية أو غير محددة، بما في ذلك. باستخدام ريجا أو إليسا. Immunoblotting هو نوع من المقايسة المناعية غير المتجانسة.

تعتمد هذه الطريقة للكشف عن الأجسام المضادة للمستضدات الفردية لمسببات الأمراض على إجراء ELISA على أغشية النيتروسليلوز، حيث يتم تطبيق بروتينات محددة في شكل نطاقات منفصلة، ​​مفصولة بالرحلان الكهربائي الهلامي. إذا كانت هناك أجسام مضادة ضد مستضدات معينة، فسيظهر خط داكن في الموضع المقابل من الشريط. يكمن تفرد الكتلة المناعية في محتواها العالي من المعلومات وموثوقية النتائج التي تم الحصول عليها.

المادة المستخدمة في الدراسة هي المصل البشري أو البلازما. للبحث على شريط واحد، مطلوب 1.5-2 مل من الدم أو 15-25 ميكرولتر من المصل.

تستخدم شركة Laboratory Diagnostics LLC مجموعات التطعيم المناعي للكشف عن الأجسام المضادة لمسببات الأمراض المختلفة من EUROIMMUN (ألمانيا)، وMIKROGEN (ألمانيا):

HSV 1 و HSV 2 الغلوبولين المناعي/IgG(عدوى فيروس الهربس)

CMV IgM/IgG(عدوى الفيروس المضخم للخلايا)

الحصبة الألمانية مفتش

ملف تعريف TORCH IgM(داء المقوسات، الحصبة الألمانية، الفيروس المضخم للخلايا، HSV 1 و HSV 2)

EBV IgMTIgG(عدوى فيروس ابشتاين بار)

فيروس التهاب الكبد الوبائي IgG(التهاب الكبد الفيروسي سي)

يتم استخدام نوعين من المجموعات - لطخة غربية ولطخة خطية.

لطخة غربية:تحتوي المجموعات على شرائط غشاء اختبار مع مستضدات أصلية مفصولة كهربائيًا للعوامل المعدية المقابلة، أي. يتم ترتيب المستضدات حسب الوزن الجزيئي. يمكن أيضًا تطبيق 1-2 خطوط إضافية تحتوي على مستضدات مهمة سريريًا (لطخة الخط الغربي) على الأغشية. هذه طريقة تأكيدية موثوقة، تقضي على الاستجابات الإيجابية الكاذبة وردود الفعل المتبادلة.

لطخة الخط:في هذه الحالة، يتم تطبيق المستضدات المهمة سريريًا فقط (الأصلية أو الاصطناعية أو المؤتلفة) على أغشية شريط الاختبار بترتيب معين. يستخدم هذا الأسلوب في التشخيص التفريقي لعدة إصابات على شريط واحد.

يكمن جوهرها في نقل جزيئات المادة قيد الدراسة من حامل صلب يستخدم لتجزئة البوليمرات الحيوية إلى حامل آخر، حيث يتم تحديدها على وجه التحديد باستخدام تفاعل كيميائي مناعي. الطريقة الحديثة عالية الحساسية تتكون من تحديد البروتينات، بما في ذلك المستضدات الفيروسية. تعتمد الطريقة على مزيج من الرحلان الكهربي الهلامي وتفاعل الجسم المضاد مع المستضد. يتم تحقيق درجة عالية من الدقة من خلال الفصل الكهربي للبروتينات والبروتينات السكرية والدهنية والحد الأقصى من الخصوصية للكشف عن الأمصال المناعية أو الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. في ظل الظروف المثالية، يمكن للتطعيم المناعي اكتشاف المستضد بكميات أقل من 1 نانوغرام في حجم الاختبار. من الناحية الفنية، يتم إجراء التطعيم المناعي في ثلاث خطوات:

1) يتم فصل البروتينات المراد تحليلها في هلام بولي أكريلاميد في وجود مواد مشوهة: كبريتات دوديسيل الصوديوم أو اليوريا، وغالبًا ما يشار إلى هذه العملية باسم SDS-PAGE؛ يمكن تصور البروتينات المنفصلة بعد تلطيخها ومقارنتها بالعينات المرجعية؛

2) يتم نقل البروتينات المنفصلة من الجل عن طريق التراكب (النشاف) على
مرشح النيتروسليلوز ومثبت عليه. في كثير من الحالات، ولكن
لا يتم دائمًا الحفاظ على النسب الكمية للبروتينات أثناء النقل؛

3) يتم تطبيق كاشفات متعددة أو وحيدة النسيلة على المرشحات
الأجسام المضادة التي تحتوي على علامة النظائر المشعة أو الإنزيم؛ ل
للكشف عن الأجسام المضادة المرتبطة، يتم أيضًا استخدام اختبار مضاد للأنواع
المصل المسمى، وبعبارة أخرى، في المرحلة النهائية من النشاف
على غرار المقايسات المناعية في المرحلة الصلبة.

يجب أن يؤخذ في الاعتبار أنه في هذا الإعداد المناعي، تكون البروتينات في حالة مشوهة، وبالتالي قد لا يتم التعرف عليها بواسطة الأجسام المضادة الخاصة بالبروتين الأصلي، ولكن في وجود الأمصال لجميع الببتيدات المكونة، يتم التعرف على الطيف المستضدي بأكمله للبروتين الأصلي. يتم الكشف عن بروتين الاختبار في وقت واحد. يُستخدم النشاف المناعي على نطاق واسع في دراسات بنية فيروسات التهاب الكبد، على وجه الخصوص، لتحديد العلاقة المستضدية بين السلالات الفردية. تتيح الدقة العالية للتخثر المناعي الحصول على نتائج جيدة في الممارسة التشخيصية، عندما يكون من الضروري التعرف على الفيروس في أنسجة المريض أو إفرازاته.

اعتمادا على المادة قيد الدراسة، يتم تمييز الحمض النووي الريبي (DNA)، والحمض النووي الريبي (RNA) والبروتين - النشاف.

يمكن إجراء الكشف الكيميائي المناعي للمستضدات باستخدام الأجسام المضادة المرتبطة بالملصق. في الآونة الأخيرة، تم استخدام النظائر المشعة أو الإنزيمات (البيروكسيديز، الفوسفاتيز القلوي، اللاكتاماز، وما إلى ذلك) على نطاق واسع كتسميات.

وقت النشاف عن طريق الانتشار هو 36-48 ساعة ولكن الطريقة الأسرع والأكثر فعالية لنقل البروتينات من المواد الهلامية هي النشاف الكهربائي، والذي يستغرق عادة 1-3 ساعات، بالنسبة لبعض البروتينات عالية الجزيئية يستغرق أكثر من 12 ساعة.

يعتمد الاختيار المحدد للمواد الماصة لإجراء تعديلات مختلفة على البقع (النيتروسليلوز أو الورق المعالج وفقًا لذلك)، واختيار شروط الحجب والكشف الكيميائي المناعي للمستضدات بشكل كامل على المستضد وكميته وطريقة المقايسة المناعية وأغراض الدراسة.

تتيح القدرة على اكتشاف الأجسام المضادة لمستضدات محددة لمسبب المرض تقييم أهمية هذه الأجسام المضادة (خصوصية عامل مسبب معين) واستبعاد التفاعل مع المستضدات المتقاطعة. وهذا ما يميز النشاف المناعي عن ELISA، حيث يمكن استخدام مجموعات مختلفة من المحددات المستضدية كمستضد - محدد وغير محدد، مما يعطي تفاعلات متقاطعة مع مسببات الأمراض الأخرى. وفي حالة أخرى، إذا تم الحصول على نتيجة إيجابية في ELISA، فلا يمكن للمرء إلا أن يفترض أن ذلك نتيجة لتفاعل متقاطع، ولكن في حالة التطعيم المناعي يكون هذا قاطعًا

لعدة أسباب، أصبحت طريقة أمن المعلومات هي الأكثر انتشارًا كطريقة مناسبة للاستخدام كاختبار تأكيد.

الميزة التي لا شك فيها لهذه الطريقة هي إمكانية اختبار الأجسام المضادة لمستضدات ضعيفة أو غير قابلة للذوبان تمامًا والقضاء على مرحلة إدخال العلامة المشعة في المستضدات.

يتم الحكم على الحساسية في حالة IB من خلال الحد الأقصى لكمية المستضد المطبق على الجل، والذي يمكن اكتشافه كيميائيًا مناعيًا أثناء تجزئة البروتين بعد نقله من الجل إلى الطور الصلب (النيتروسليلوز). تعتمد الحساسية العامة للمقايسة على عدد من العوامل: ظروف تجزئة وتثبيت المستضد على حامل صلب، ومستوى الخلفية، ونوعية الأجسام المضادة وتقاربها. يعد نوع العلامة المستخدمة وطريقة التعرف عليها أمرًا مهمًا.

وبالتالي، فإن طريقة النشاف المناعي تجعل من الممكن تحديد مناطق المستضد في المرحلة الصلبة دون ربط البروتين بأكمله بأجسام مضادة محددة في المصل. تُستخدم اللطخة المناعية وتعديلاتها بشكل أساسي لكتابة المستضدات والأجسام المضادة البكتيرية والفيروسية، خاصة في حالة عدم دقة الأنظمة التقليدية، وكذلك في تحليل الغلوبولين المناعي، والأحماض النووية، أو كاختبار تأكيد بالاشتراك مع طرق أخرى.

هناك صعوبات كبيرة في تفسير نتائج المقطع العرضي في التفاعلات وفي حالات المراحل الأولية للتحويل المصلي. في الحالة الأولى، خلال دراسة متكررة بعد فترة زمنية معينة، لم يتم الكشف عن أي أجسام مضادة، ولكن في الحالة المناعية الثانية تظهر نطاقات جديدة، مما يشير إلى ظهور أجسام مضادة لبروتينات فيروس نقص المناعة البشرية أو البروتينات السكرية، مما يميز ديناميكيات الاستجابة للتفاعل المناعي ضد مستضدات الفيروس.

إنها في الواقع طريقة التحقق النهائية في سلسلة الدراسات المصلية، مما يسمح للمرء بالتوصل إلى نتيجة نهائية حول إصابة المريض بفيروس نقص المناعة البشرية أو رفضها. لإجراء IB، يتم استخدام شرائح النيتروسليلوز، والتي يتم نقل بروتينات فيروس نقص المناعة البشرية عليها سابقًا عن طريق الرحلان المناعي الأفقي ثم الرأسي من أجل زيادة الأوزان الجزيئية. تتفاعل الأجسام المضادة الموجودة في الأمصال المختبرة مع البروتينات الموجودة في مناطق معينة من الشريط. لا يختلف المسار الإضافي للتفاعل عن ذلك الخاص بـ ELISA، أي أنه يتضمن معالجة الشريط باستخدام مادة مترافقة وركيزة كروموجين، وغسل المكونات غير المرتبطة وإيقاف التفاعل بالماء المقطر. يتيح الفصل الكهربي الأولي للبروتينات وتثبيتها على النيتروسليلوز تحديد الأجسام المضادة لبروتينات معينة وفقًا لوجود (أو عدم وجود) تلطيخ (أزرق رمادي) للمناطق المقابلة من الشريط. لا يمكن استخدام اللطخة المناعية في دراسات الفحص الشامل بسبب تكلفتها العالية وهي طريقة للتحكيم الفردي في المرحلة النهائية من الدراسة المصلية.

هناك علاقة واضحة إلى حد ما بين نتائج اختبار المصل في IB وELISA. يتم بعد ذلك تفسير الأمصال الإيجابية مرتين في ELISA (في أنظمة اختبار مختلفة) في IB على أنها إيجابية لفيروس نقص المناعة البشرية في 97-98٪ من الحالات. الأمصال الإيجابية في ELISA في نظام واحد فقط من نظامي الاختبار المستخدمين تبين أنها إيجابية لفيروس نقص المناعة البشرية في IB ليس أكثر من 4٪ من الحالات. عند إجراء دراسات تأكيدية، يمكن لحوالي 5٪ من البكالوريا الدولية إعطاء ما يسمى بالنتائج "غير المحددة"، والتي، كقاعدة عامة، تتوافق مع ELISA الإيجابي، ولكن ليس RIP. في ما يقرب من 20٪ من الحالات، تنتج الـ IBs "غير المحددة" عن الأجسام المضادة لبروتينات هفوة فيروس نقص المناعة البشرية -1 (ص55، ص25، ص18). إذا تم الحصول على نتائج مناعية مشكوك فيها، فيجب تكرار الدراسة بعد 3 أشهر، وإذا ظلت النتيجة غير مؤكدة، بعد 6 أشهر.

المقايسة المناعية الإشعاعية (RIM) (المقايسة المناعية الإشعاعية، RIA)المقايسة المناعية الإشعاعية هي طريقة للتحديد الكمي للمواد النشطة بيولوجيًا (الهرمونات والإنزيمات والأدوية وما إلى ذلك) في السوائل البيولوجية، استنادًا إلى الارتباط التنافسي للمواد المستقرة والمشابهة التي تحمل علامات النويدات المشعة مع أنظمة ربط محددة. غالبًا ما تكون هذه الأخيرة أجسامًا مضادة محددة. نظرًا لإضافة المستضد المسمى بكمية معينة، فمن الممكن تحديد جزء المادة المرتبط بالأجسام المضادة والجزء الذي يظل غير منضم نتيجة التنافس مع المستضد غير المسمى المكتشف. يتم إجراء الدراسة في المختبر. ل ر.أ. إنتاج مجموعات قياسية من الكواشف، كل منها مصمم لتحديد تركيز مادة واحدة. يتم إجراء الدراسة على عدة مراحل: يتم خلط المواد البيولوجية مع الكواشف، ويتم تحضين الخليط لعدة ساعات، ويتم فصل المواد المشعة الحرة والمرتبطة، ويتم إجراء قياس إشعاع العينة، ويتم حساب النتائج. هذه الطريقة حساسة للغاية، ويمكن استخدامها في تشخيص أمراض القلب والأوعية الدموية والغدد الصماء وغيرها من الأجهزة، لتحديد أسباب العقم، واضطرابات نمو الجنين، في علم الأورام لتحديد علامات الورم ومراقبة فعالية العلاج، لتحديد تركيز الغلوبولين المناعي والإنزيمات والمواد الطبية. في بعض الحالات، يتم إجراء الدراسات على خلفية اختبارات الإجهاد الوظيفية (على سبيل المثال، تحديد مستويات الأنسولين في مصل الدم على خلفية اختبار تحمل الجلوكوز) أو في الديناميكيات (على سبيل المثال، تحديد الهرمونات الجنسية في الدم أثناء دورة الطمث).

باستخدام مجموعة تجارية من ABBOTT - Austria II-I 125، من الممكن اكتشاف HBsAg بتركيزات تصل إلى 0.1 نانوغرام/مل. وتشمل مزايا الطريقة إمكانية توحيد الطريقة وأتمتتها مع الحصول على الإجابات من الناحية الرقمية. عيب هذه الطريقة هو القيود التي تحددها طريقة التشغيل مع المواد المشعة والعمر الافتراضي القصير نسبيًا لمجموعة أدوات التشخيص، والذي يرتبط بتدهور الملصق المشع.

يتم إنتاج مجموعات التشخيص لتحديد المستضدات المختلفة لفيروسات التهاب الكبد A وB وD والأجسام المضادة لها من قبل شركة Izotop (طشقند) وبعض الشركات الأجنبية (على سبيل المثال، ABBOTT). تُستخدم كرات البوليسترين ("EBBOTT") أو أنابيب الاختبار ("النظائر") كمرحلة صلبة. لتسمية الأجسام المضادة أو المستضدات، يتم استخدام النظير I 125 في أغلب الأحيان، والذي يبلغ نصف عمره 60 يومًا ونشاط إشعاعي محدد مرتفع. يتم قياس التتبع الإشعاعي، أي الإشعاع، على عدادات خاصة - مطياف الراديو. يتم إحصاء النبضات المشعة في كل من عينات التحكم والاختبار في وقت محدد واحد، عادة خلال دقيقة واحدة. عند تحليل نتائج التفاعل، من الضروري أن نأخذ في الاعتبار وجود نشاط إشعاعي في الخلفية، والذي يمكن أن يؤثر على النتيجة النهائية للتفاعل. قد تكون أسباب زيادة الخلفية: تلوث حاوية العينة أو العش؛ إعدادات الجهاز غير صحيحة. وجود مصدر إشعاع قوي بالقرب من الجهاز.

لتأكيد النتيجة الإيجابية التي تم الحصول عليها أثناء الفحص الأولي للعينات، يوصى بتكرار الاختبار باستخدام RIA أو اختبار بديل. إذا تم الكشف عن HBsAg، يجب إجراء اختبار التأكيد.

الجدول 1. تصنيف اللقاحات

فهرس:

إلزامي:

1. خايتوف آر إم، إجناتيفا جي إيه، سيدوروفيتش آي جي. علم المناعة: كتاب مدرسي.-م: الطب، 2000.- 432 ص: مريض (كتاب مدرسي لطلاب الجامعات الطبية).

2. كوفالتشوك إل.في. وآخرون. علم المناعة: ورشة عمل: كتاب مدرسي. دليل – م.: GEOTAR-Media، 2012. – 176 ص.

3. بوزديف أوك. علم الأحياء الدقيقة الطبية / إد. أكاد. رامس ف. بوكروفسكي - م: جيوتار-ميديا، 2001. – 768 ص.

4. بوريسوف إل.بي. دليل للدروس العملية في علم الأحياء الدقيقة. م 1997

إضافي:

1. جينكل بي إيه، علم الأحياء الدقيقة مع أساسيات علم الفيروسات. م، 1974

2. كوروتيايف إيه آي، بابيتشيف إس. إيه. علم الأحياء الدقيقة الطبية والمناعة وعلم الفيروسات: كتاب مدرسي عن العسل. الجامعات - الطبعة الثالثة، المنقحة. وإضافية – سانت بطرسبرغ، SpetsLit. 2002. – 591 ص.

3. بوريسوف إل بي، سميرنوفا إيه إم، علم الأحياء الدقيقة الطبية، علم الفيروسات، علم المناعة، ماجستير، الطب. 1994

4. تيماكوف في.د.، ليفاشوف في.س.، بوريسوف إل.بي. علم الاحياء المجهري. م 1983

مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)

مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) تتم على مرحلتين: الأولى تفاعل الأجسام المضادة مع المستضد، والثانية هي الإشارة الأنزيمية لمركب المستضد-الجسم المضاد نتيجة لظهور اللون في خليط التفاعل وتسجيل اللون بصريا أو بالطريقة الطيفية. .

هناك خياران لـ ELISA: الطور الصلب والطور السائل، ويختلفان في طريقة فصل مكونات التفاعل الكيميائي المناعي. بالمقارنة مع الطرق الموصوفة مسبقًا للكشف عن المستضدات والأجسام المضادة، يتمتع ELISA بمزايا كبيرة:

حساسية عالية، مما يسمح باكتشاف ما يصل إلى 0.05 نانوغرام/مل من المادة؛

القدرة على استخدام كميات قليلة من مادة الاختبار (1-2 ميكرولتر)؛

إمكانية التسجيل الآلي أو المرئي للتفاعل؛

التعبير والقدرة على أتمتة جميع مراحل التفاعل.

يستخدم ELISA حاليًا على نطاق واسع في الممارسة العملية لتشخيص العديد من الأمراض المعدية ذات المسببات البكتيرية والفطرية والتهابات الأوالي والديدان الطفيلية، ولكن بشكل خاص الالتهابات الفيروسية، ولا سيما التهاب الكبد A، B، C، D، E، G، الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، فيروس الهربس، فيروس الروتا، الفيروس الغدي، الفيروس النجمي، الفيروس الصغير وأنواع العدوى الأخرى.

النشاف المناعي

مبدأ طريقة التطعيم المناعي هو اكتشاف الأجسام المضادة للمستضدات الفردية للعامل الممرض. باستخدام هذه الطريقة، يتم تحديد الأجسام المضادة لمستضدات فيروس نقص المناعة البشرية (البروتينات السكرية المغلف الفيروسية، والبروتينات الأساسية والإنزيمات الفيروسية). يتم تقييم نتائج التطعيم المناعي على أنها إيجابية ومشكوك فيها وسلبية اعتمادًا على المجموعة الكمية والنوعية من الأجسام المضادة المكتشفة.

تجدر الإشارة إلى أن النشاف المناعي أقل حساسية لـ ELISA، وفي بعض الحالات قد يتم تسجيل نتيجة سلبية إذا كان المريض مصاباً بفيروس نقص المناعة البشرية. ومع ذلك، فإن إمكانية تسجيل نتائج إيجابية كاذبة في ELISA للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية تتطلب اتباع نهج متكامل لتشخيص الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، مع الأخذ في الاعتبار، بالإضافة إلى نتائج التفاعلات المناعية (ELISA، المناعية) والبيانات الوبائية والسريرية.

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

تم تطوير طريقة PCR من قبل عالم الكيمياء الحيوية الأمريكي كاري موليس في عام 1983 بناءً على استخدام بوليميراز الحمض النووي القابل للحرارة (Tag بوليميريز) الذي اكتشفه. مبدأ الطريقة هو زيادة عدد نسخ منطقة معينة من الحمض النووي للعامل الممرض بمقدار 10 6 – 10 8 مرات، ويتم تحفيزها في المختبر بواسطة بوليميراز الحمض النووي في الوضع التلقائي.

في ظل الظروف الاصطناعية، من الممكن إعادة إنتاج عملية النسخ لمنطقة الجينوم الخاصة بنوع أو جنس معين من مسببات الأمراض بشرط أن يكون تسلسل النيوكليوتيدات الخاص بها معروفًا. يتيح لنا استخدام طرق الكشف عن منتجات النسخ المتماثل لهذه المناطق (الأمبليكونات) تحديد وجود العامل الممرض في عينة الاختبار.

يبدأ بناء السلسلة التكميلية الموصوف أعلاه فقط في كتل بداية معينة، وهي عبارة عن أقسام قصيرة مزدوجة الجديلة. عندما يتم ربط هذه الكتل بأجزاء محددة من الحمض النووي، يتم توجيه عملية تصنيع سلسلة جديدة فقط في القسم المحدد، وليس على طول سلسلة الحمض النووي بالكامل. لإنشاء كتل البداية في أقسام معينة من الحمض النووي، يتم استخدام اثنين من بادئات قليل النوكليوتيد، تسمى البادئات. تعتبر البادئات مكملة لتسلسلات الحمض النووي على الحدود اليسرى واليمنى لجزء معين ويتم توجيهها بحيث يتم إكمال شريط DNA الجديد بينهما فقط.

ل مميزات طريقة PCRيجب ان يتضمن:

حساسية عالية، مما يسمح بتحديد 10-1000 خلية في العينة؛

خصوصية عالية، حيث أن مادة الاختبار تكشف عن جزء من الحمض النووي فريد لمسبب مرض معين؛

عالمية الإجراء الخاص باكتشاف مسببات الأمراض المختلفة من عينة حيوية واحدة؛

سرعة التحليل العالية (4--4.5 ساعة)؛

إمكانية تشخيص ليس فقط الالتهابات الحادة، ولكن أيضا الكامنة.

يعد استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل فعالاً في تشخيص مجموعة واسعة من الالتهابات البكتيرية والفيروسية.

في الآونة الأخيرة، تم تنفيذ الطرق الكمية لتحليل PCR بنجاح كبير، مما يجعل من الممكن تحديد تركيز العامل الممرض في المادة (الحمل الميكروبي أو الفيروسي)، على سبيل المثال، لتقييم النشاط التكاثري لفيروس التهاب الكبد B، وفيروس نقص المناعة البشرية C .

ومع ذلك، ينبغي أن يؤخذ في الاعتبار أن طريقة PCR لها أيضًا حدودها، على وجه الخصوص، في تشخيص الالتهابات الناجمة عن النباتات الذاتية الانتهازية.

تهجين الحمض النووي

تهجين الأحماض النووية، مثل PCR، فهو يسمح لك بتحديد العامل الممرض في العينة دون عزل مسبق. لإجراء التحليل، يتم تصنيع مسبار DNA أو RNA أحادي الجديلة، مكملاً لتسلسلات النيوكليوتيدات المحددة للعامل الممرض. يتم وضع علامة على المسبار باستخدام النويدة المشعة أو الإنزيم أو أي علامة أخرى يمكن التعرف عليها بسهولة. تخضع المادة قيد الدراسة للمعالجة بغرض تحلل الكائنات الحية الدقيقة الموجودة في الاختبار الحيوي وعزل الحمض النووي وتمسخه. بعد ذلك، يتم احتضان المسبار مع عينة الاختبار ويتم قياس كمية الحمض النووي المسمى الذي دخل في التهجين مع الحمض النووي في عينة الاختبار. يمكن أن يحدث التفاعل على المواد الماصة ذات الطور الصلب وفي المحلول، ولكن الشرط الأساسي هو غسل كميات غير مرتبطة من المسبار المسمى. حساسية طريقة تهجين الحمض النووي أقل من حساسية PCR وتبلغ 10 3 خلايا ميكروبية في العينة.