Направление на ифа. Иммуноферментный анализ (ELISA)

Анализ ИФА (иммуноферментное исследование) - современная диагностическая процедура, направленная на выявление в крови специфических антител к возбудителям ряда заболеваний, определение стадии развития патологии и ее этиологии. Применяется как метод контроля за процессом лечения и его эффективностью. В процессе исследования анализируются качественные и количественные показатели.

Метод ИФА обладает высокой информативностью, точность результатов составляет более 96%. Диагностика доступна практически в любой лаборатории и медицинском учреждении.

Основные показания

Иммуноферментное исследование назначается с целью подтверждения наличия инфекционных заболеваний, передающихся половым путем:

• трихомониаза;
• хламидиоза;
• уреаплазмоза;
• сифилиса и др.

Также ИФА применяется для диагностики вирусных заболеваний:

• герпеса;
• герпеса 4 типа (вирус Эпштейна-Барра);
• вирусного гепатита;
• цитомегаловирусной инфекции.

Как подготовиться к исследованию

Биологическим материалом для исследования служит кровь. За несколько дней до ее сдачи исключается прием медикаментозных препаратов. За 14 дней останавливается прием антибиотиков, противогельминтных и противовирусных средств.

Забор материала осуществляется утром натощак. За час до процедуры разрешается выпить стакан воды без газа, прием пищи исключается.

Особенности анализа

Для проведения исследования берется венозная кровь, в объеме не менее 5 мл. В отдельных случаях в качестве биоматериала используется спинномозговой ликвор, амниотическая жидкость или содержимое стекловидного тела.

Забор крови осуществляется при помощи инъекционной иглы, строго натощак, с целью избежания ложноположительных результатов. За 12 часов следует отказаться от курения и приема алкогольных напитков. При употреблении наркотических веществ результаты анализа искажаются.

Если в заключении указаны отрицательные значения иммуноглобулинов G, А, М, это говорит о начальной фазе развития патологического процесса либо о его отсутствии. Такой результат регистрируется при полном выздоровлении на фоне проведенной терапии.

Отрицательный результат IgM и IgA и положительный IgG говорят о формировании иммунитета после инфекционного заболевания или вакцинации.

Положительный результат IgM и отрицательный или положительный результат IgG, IgA свидетельствуют о наличии острой инфекционной патологии.

Анализ ИФА проводится достаточно быстро, результаты готовы через сутки после забора материала.

(ИФА) - это способ исследования крови в лаборатории, основанный на поиске специальных клеток - антител к различным заболеваниям. Метод позволяет не только выявить возбудителя, но и установить, на какой стадии находится патологический процесс. Последнее очень важно для прогноза и дальнейшего лечения пациента.

Преимущества и недостатки метода

Среди всех современных методов диагностики ИФА является самым инновационным и технически точным. Его основными преимуществами являются:

1. Способность поиска всех существующих антител к инфекционным заболеваниям в крови пациента.
2. Высокая доступность метода исследования. На сегодняшний день анализы методом ИФА может выполнить любая лаборатория среднего масштаба.
3. Практически 100% специфичность и чувствительность метода.
4. Возможность поиска антител и антигенов, а также установление стадии патологического процесса и отслеживание его динамики, благодаря сравнению количества.

Такое количество преимуществ перед другими анализами полностью затмевает один-единственный недостаток анализа: он способен выявлять антитела, но не самого возбудителя.

Основные термины для оценки анализа

Для того чтобы разобраться в том, какой бывает ИФА-анализ, что это такое и как выполняется, нужно познакомиться с основными терминами, применяемыми специалистами.

1. Антитело - белок, который вырабатывается клетками иммунной системы человека (лимфоциты типа В). Они отвечают специфической реакцией на попадание в организм чужеродного агента или вещества. Другое название антител - иммуноглобулины, они принадлежат к разным классам: A, E, M, G. Они отличаются друг от друга массой, скоростью реагирования, периодом полураспада и рядом других характеристик. В норме кровь человека содержит в основном иммуноглобулины класса G. Если происходит какое-либо инфицирование, то резко увеличивается количество иммуноглобулинов A и M. Иммуноглобулины E принимают участие в аллергических реакциях.
2. Антиген - чужеродный агент, имеющий органическое происхождение и высокую молекулярную массу. Чаще всего представляет собой возбудителей или их биологически активные вещества.
3. Комплекс "антиген-антитело", или иммунный комплекс, - это непосредственно комбинация чужеродного вещества и иммуноглобулина, дающая развитие иммунной реакции.

Суть и область применения метода

У пациентов зачастую возникает вопрос: ИФА-анализ, что это такое, как выполняется и для чего он нужен? Доступно о методе можно рассказать, описав вкратце его стадии.

Подготовительная стадия . Врач лаборатории использует специальный планшет, в котором 96 лунок. На поверхность каждой лунки нанесен антиген определенного возбудителя.

Стадия 1. Выполняется забор крови, которая затем по капле наносится на лунку. В лунке запускается реакция между антигеном и антителом в крови.

Стадия 2. В лунке полным ходом идет реакция с образованием иммунных комплексов. В результате образуется вещество определенного цвета. Интенсивность окраски зависит от количества антител в крови пациента к каждому конкретному возбудителю.

Стадия 3. Оценка результата путем фотометрии. Для этого применяется специальный прибор под названием "спектрофотометр". С его помощью сравнивается плотность материала в лунке и контрольного образца. Далее прибор путем математического анализа генерирует результат.

Оценка результатов и предназначение ИФА

Интерпретация результата зависит от нескольких важных нюансов:

1. Оптической плотности лунки.
2. Производителя пластины с лунками (тест-системы).
3. Лаборатории, в которой выполнялось исследование.

Учитывая эти нюансы, никогда не следует сравнивать два результата с разных тест-систем или из разных лабораторий.

Еще одним немаловажным моментом, влияющим на анализ ИФА, является так называемая авидность антител. Этот параметр характеризует количество антигена, прочность связи в комплексе "антиген-антитело". В основе его определения лежит обработка иммуннокомплекса мочевиной с целью разрешения белковых структур. Это позволяет разрушить слабые связи между антигеном и антителом и оставить только прочные. Значение исследования на авидность заключается в том, что с его помощью можно узнать срок инфицирования. Эта информация чрезвычайно важна для постановки диагноза беременным женщинам.

Анализ крови методом ИФА служит:

1. Для поиска различных антигенов возбудителей.
2. Для исследования гормонального фона.
3. Для обследования на наличие аутоиммунной патологии.
4. Для обнаружения маркеров онкологических заболеваний.

Разновидности ИФА

Анализ ИФА имеет следующие разновидности:

1. Непрямой.
2. Прямой.
3. Конкурентный.
4. Метод блокирования.

Но на деле сегодня применяется только способ под названием ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). В его основе лежит вышеописанная реакция образования комплекса антигена с антителом с изменением окраски на поверхности лунки.

Отдельного внимания заслуживает непосредственно количественный ИФА-анализ крови. Это не разновидность анализа, а способ оценки результатов. Благодаря ему подсчитывается количество антител и определяются их классы. Результат зависит от оптической плотности пробы, тест-системы, на которой выполнялся анализ ИФА, а также от лаборатории.

Заболевания, выявляемые ИФА

ИФА - анализ крови, позволяющий выявить огромное количество различных инфекционных заболеваний. Притом с одинаковой точностью выявляются как вирусные, так и бактериальные заболевания. Например, с помощью образования иммуннокомплексов можно доказать наличие антигенов возбудителей следующих заболеваний:

Кроме того, ИФА позволяет обнаружить:

1. Маркеры онкологических заболеваний - ФНО (фактор некроза опухоли), ПСА (простатспецифический антиген), РЭА (раково-эмбриональный антиген), СА-125 (маркер опухолей яичников)
2. Гормон беременности — ХГЧ (хорионический гонадотропин).
3. Нарушения репродуктивной системы: гормоны женской и мужской половой систем.
4. Патологию щитовидной железы.

Важно упомянуть, что анализ ИФА на ВИЧ сегодня является главным способом диагностики этого опасного заболевания.

Материал для ИФА и техника забора

Для выполнения ИФА у пациента производится забор крови натощак. Далее из крови получают сыворотку, которая непосредственно используется для проведения анализа. Кроме того, ИФА можно проводить на спинномозговой жидкости (ликворе), слизи цервикального канала (шейки матки), околоплодных водах и даже жидкости стекловидного тела (глазного яблока).

Перед сдачей крови пациента предупреждают о том, что он не должен принимать никаких лекарственных препаратов, а лечение антибиотиками и противовирусными препаратами рекомендуется заканчивать не менее чем за две недели до забора крови.

Сроки получения и расшифровка результатов

Сроки получения ответа из лаборатории зависит не от скорости ее работы, а от того, на какой стадии находится заболевание и какие антитела уже появились в крови. Так, к примеру: иммуноглобулины М появляются примерно через 2 недели после взятия крови на анализ и означают, что процесс находится на стадии первичного инфицирования или произошло обострение хронического. Одновременно антитела классов M и G появляются при первичной инфекции. Притом последние могут обнаруживаться спустя 4 недели.

IgA появляются спустя 2-3 недели либо в одиночку, либо вместе с М, означая острую инфекцию, или вместе с G, указывая на хронический процесс.

Такие разные сроки появления антител в крови заставят пациента долго ожидать результата. Допустимо ожидание более месяца после того, как выполнен анализ ИФА. Расшифровка и интерпретация врачом также занимают определенный промежуток времени.

Как проводится исследование методом ИФА

Механизм реакции

В основе иммуноферментного анализа лежит иммунная реакция антигена с антителом,а присоединение к антителам ферментной метки позволяет учитывать результат реакции антиген-антитело по появлению ферментативной активности или по изменению ее уровня.В упращенном виде механизм реакции можно представитьследующим образом:

Подсчет результатов

Проведение иммуноферментного анализа

Для серодиагностике используются 96 луночные полистирольные планшеты, на стенках ячеек которых заранее адсорбируется антиген. Исследуемая сыворотка вносится в ячейку планшета. При этом гомологичные антигену антитела прикрепляются к нему. Не прикрепившиеся антитела удаляются промыванием. Далее в ячейки вносят антитела против иммуноглобулинов (антител) человека, меченные ферментом. Если в исследуемой сыворотке присутствовали определяемые антитела, то они на этом этапе выступят в роли антигенов, с которыми прореагируют меченные антитела. Добавление после промывки хромогенного вещества (красителя) позволит учесть реакцию по развивающемуся окрашиванию в ячейках. Интенсивность окраски при этом пропорциональна количеству фермента, а следовательно количеству антител.При измерении оптическую плотности (ОП) жидкости в ячейке и сравнивании ее с контрольным образцом подсчитывается концентрация антител в единицах объема.Наиболее часто применяется подсчет результатов в единицах оптической плотности.Надо учитывать,что для каждой тест-системы есть свои показатели учета результатов и показатели нормы и патологии на которые надо ориентироваться при интерпретации результатов.

Какие инфекции можно выявить методом ИФА

В основном в современной венерологии применяется для диагностики сифилиса (в комплексе с другими реакциями),ВИЧ-инфекции ,вирусных гепатитов .Имеет ограниченное значение для диагностики хламидийной инфекции ,цитомегаловирусной инфекции и других герпетических инфекций .Метод ИФА используется также для определения антител при различных инфекционных заболеваниях,уровня гормонов,аутоантител и различных маркеров онкологических заболеваний.

Как интерпретировать результаты ИФА

Исследование наличия и уровня антител различных классов в некторых случаях помогает определить стадии инфекционного процесса

К сожалению,такое важное преимущество ИФА, как количественное определение антител не имеет большого значения в практической работе - т.е. не позволяет точно установить диагноз и не влияет на дозировку и сроки назначения лекарственных средств.

Какая роль метод ИФА в диагностике сифилиса

Метод ИФА в диагностике сифилиса был впервые применен в 1975 год.В настоящее время он широко применяется для серологической диагностики сифилиса в России и используется как потверждающий тест на сифилис.Обычно проводят исследование,выявляющее так называемые суммарные антитела к антигенам бледной трепонемы (IgM и IgG),хотя в отдельных случаях возможно и определение только "ранних" антител класса М.ИФА при сифилисе становится положительным после 3 недели с момента инфицирования и остается положительным довольно длительное время даже после лечения (иногда всю жизнь).Поэтому как тест,подтверждающий излечение сифилиса,ИФА не используется.В большинстве случаев проводится только качественное определение ИФА - т.е. только положительный или отрицательный результат,хотя возможно и количественное определение.

В диагностике вирусных болезней человека и животных широко применяют методы, основанные на использовании ферментов в качестве метки антигенов и антител. Это группа методов носит название иммуноферментного анализа.

ИФА применяют в двух вариантах: гистохимическом и твердофазном.

Гистохимический вариант ИФА, или иммунопероксидазную реакцию, используют редко. Он аналогичен методу иммунофлуоресценции, но отличается тем, что для постановки реакции используют антитела, меченные не флуорохромом, а ферментом.

Для метки антител обычно применяют ферменты: пероксидазу хрена (чаще), щелочную фосфатазу, галактозидазу и др.

Таким образом, в комплекс антиген + антитело включаются антитела, меченные ферментом, и для обнаружения этого комплекса вносят субстрат (фермент-чувствительное вещество), которое под действием фермента разлагается, образуя цветной продукт ферментативной реакции, хорошо видимый в световом микроскопе.

В качестве субстрата используют ортофенилендиамин, 5-аминосалициловую кислоту или бензидин. К ним добавляют пероксид водорода (Н 2 O 2).

Материалом для выявления вирусных антигенов при этом варианте могут быть: мазки; отпечатки различных органов; парафиновые срезы; культуры клеток. При этом можно использовать как прямой, так и непрямой метод.

Прямой метод . На фиксированный препарат наносят конъюгат (антитела к предполагаемому вирусу, меченные ферментом), выдерживают при 37 °С в течение 1-2 ч во влажной камере, затем препарат отмывают физиологическим раствором от несвязанного конъюгата, подсушивают на воздухе, наносят несколько капель раствора субстрата, инкубируют 5- 10 мин и промывают физиологическим раствором. Затем споласкивают дистиллированной водой, и результат учитывают с помощью светового микроскопа. В положительных случаях, т. е. при наличии антигена в исследуемом материале, видны или диффузное желто-коричневое окрашивание, или гранулы коричнево-черного цвета. В контрольных препаратах окрашивания не обнаруживают.

Непрямой метод . На фиксированный препарат наносят специфическую к предполагаемому вирусу сыворотку, выдерживают при 37 °С в течение 1-2 ч во влажной камере, промывают физиологическим раствором, подсушивают на воздухе и наносят меченную ферментом антивидовую сыворотку, выдерживают при 37 °С 1-6 ч. Далее следует процедура, как в прямом методе.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ТФИФА, РЭМА - реакция энзиммеченых антител, ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay) в последние годы широко используют в биологии, в том числе и в вирусологии. Характерная особенность метода в том, что один из компонентов реакции (антиген или антитело) фиксируют на твердом носителе. В качестве носителей используют полистироловые микропанели, шарики, палочки и др.

Этим методом можно обнаружить и идентифицировать антиген, а также выявить антитела и определить их титр в сыворотках крови.

Существует много вариантов метода. Наиболее часто для обнаружения антигенов используют прямой метод («сандвич»-метод). Для этого специфические к предполагаемому антигену антитела фиксируют в лунках микропанелей, в которые вносят исследуемый антиген и выдерживают при 37 °С 1-2 ч. Затем микропанели промывают буферным раствором и вносят в лунки меченные ферментом к предполагаемому антигену антитела, выдерживают при 37 °С 1-2 ч, промывают микропанели, вносят раствор субстрата и выдерживают 5-30 мин. Реакцию останавливают добавлением раствора серной кислоты и учитывают визуально по разности в окраске опытных и контрольных образцов или при помощи спектрофотометрии. Положительные образцы имеют окраску от желтой до оранжево-коричневой.

Обнаружение и определение титра антител проводят непрямым твердофазным методом.

В крупных диагностических лабораториях применяют полностью автоматизированные установки для проведения твердофазного ИФА, позволяющие анализировать от 1000 до 4000 проб ежедневно.

Достоинства ИФА: высокая чувствительность; специфичность; простота техники постановки; требуется минимальное количество компонентов; не требуется специальных приборов; оценку можно проводить визуально; возможность автоматизации, что позволяет его применять для массовых исследований; исследуемые сыворотки не требуют предварительной обработки. Это - экспресс-метод диагностики, так как в течение нескольких часов можно получить ответ.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .

Содержание

Для оценки способности организма сопротивляться инфекционным болезням или для определения фазы патологии применяют анализ крови. Метод ИФА занимает важное место среди лабораторных исследований, он помогает всесторонне изучить деятельность защитной функции крови, определить иммунодефицит при инфекционных заболевания, недугах крови, гормональных, аутоиммунных процессах.

Что такое иммуноферментный анализ крови

Этот метод относится к лабораторным исследованиям, определяет наличие защитных факторов крови белковой природы (антител) к определенным болезнетворным агентам (антигенам) . Иммуноферментный анализ крови определяет иммуноглобулины, которые могут обнаруживаться в виде иммунокомплексов. Появляются они при возникновении сложных нейрогуморальных реакций иммунной защиты человека, которые становятся ответом на внедрение чужеродных антигенов.

Против каждого вида болезнетворного агента производятся в организме специфические антитела. Далее происходит связывание патологического микроорганизма или антигена, образуется комплексное соединение «антиген-антитело». Затем оно нейтрализуется, происходит ферментативный лизис, реакция фагоцитоза, и заканчивается процесс выводом из организма. Наличие конкретных комплексов, определяющееся ИФА, говорит о виде возбудителя, вредного вещества у больного.

Классы иммуноглобулинов

Учеными обнаружено и изучено 5 видов иммуноглобулинов: IgE, IgD, IgG, IgM, IgА . Существуют и другие классы, но они находятся еще на стадии исследования, и не до конца выяснена их роль. В практической медицине важное значение имеют А, М, G. Информативность, точность определения базируется на временных промежутках, за которые они появляются, достигают максимума и исчезают.

Показания к исследованию крови методом ИФА

При помощи этого анализа можно оценивать эффективность лечения, проводить комплексное исследование перед трансплантологическими операциями, определять состояние иммунодефицита и антитела к более 600 видов аллергенов . Исследование крови методом ИФА использует в качестве дополнительного способа обнаружения онкологических клеток. Назначают анализ при необходимости обнаружения антител к микробам, которые провоцируют венерические патологии:

• трихомониаз;
• сифилис;
• токсоплазмоз;
• микоплазмоз;
• уреаплазмоз.

При глистных инвазиях в анализе ИФА будет отмечен рост количества иммуноглобулинов. Проводится исследования для подтверждения наличия у больного:

• вируса Эпштейна-Барра;
• герпетических инфекций;
• цитомегаловируса;
• группы вирусных гепатитов.

Анализ крови методом ИФА

Иммуноферментное исследование крови не единственный вариант для определения иммуноглобулинов. Иногда для этого исследования делают забор спинномозговой жидкости, ткани стекловидного тела, околоплодных вод. При использовании крови набирают ее из локтевой вены при помощи инъекционной иглы. Сдавать анализ необходимо натощак, перед ИФА не рекомендуется принимать медицинские препараты, которые могут повлиять на результат. Следует отказаться от алкоголя, курения, употребления наркотических веществ перед сдачей биоматериала. Варианты результатов теста:

1. При отрицательных показателях иммуноглобулинов IgG, IgM, IgA, врачи говорят об отсутствии патологии или начальной стадии. Такой же результат (отрицательный) будет после полного выздоровления по прошествии длительного периода.
2. Если IgG проявляется положительно, а IgM и IgA не обнаружены, это указывает на образование иммунитета после прививки или инфекционной болезни.
3. При высоких титрах IgM и отрицательных IgA, IgG ставят диагноз острого инфекционного заболевания.
4. При положительном показателе IgG, IgM, IgA врачи говорят об острой фазе рецидива уже имеющегося хронического недуга.
5. При хронической инфекции, которая находится на стадии стихания (ремиссии), анализ ИФА показывает отрицательные титры IgM, а IgA и IgG будут положительными.

Преимущества и недостатки ИФА анализа

Основным отрицательным моментом этого исследования является вероятность получения ложноположительных или ложноотрицательных результатов. Причиной недостоверности становится прием медикаментов, технические недочеты лаборатории. Фальсифицировать анализ может процесс нарушения метаболизма в организме. Главными достоинствами анализа ИФА являются:

• точность, диагностическая специфичность;
• невысокая себестоимость анализа;
• скорость получения результатов;
• возможность динамического контроля стадии патологии, эффективности лечения;
• простота исследования;
• возможность выполнять массовые обследования очагов инфекции;
• безболезненность, безопасность для больного;
• применение при обработке информационных технологий.

Видео

Нашли в тексте ошибку?
Выделите её, нажмите Ctrl + Enter и мы всё исправим!