9. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний
Основным методом микробиологической диагностики и «золотым стандартом» микробиологии, является бактериологический метод.
Цель бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя заболевания из исследуемого материала, накопление чистой культуры и идентификация данной культуры по набору свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, по наличию факторов патогенности, токсигенности и определение его чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам.
Бактериологический метод исследования включает:
1. посев исследуемого материала в питательные среды
2. выделение чистой культуры
3. идентификацию микроорганизмов (определение принадлежности к виду).
Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий предусматривает проведение следующих исследований:
I этап (работа с нативным материалом)
Цель: получение изолированных колоний
1. Предварительная микроскопия дает ориентировочное представление о микрофлоре
2. Подготовка материала к исследованию
3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний
4. Инкубация при оптимальной температуре, чаще всего 37°С, в течение 18-24 часов
II этап
Цель: получение чистой культуры
1. Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний).
2. Микроскопическое изучение изолированных колоний
3. Постановка пробы на аэротолерантность (для подтверждения присутствия в исследуемом материале строгих анаэробов).
4. Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях.
III этап
Цель: идентификация выделенной чистой культуры
1. Для идентификации выделенной культуры по комплексу биологических свойств изучается:
морфология и тинкториальные свойства
культуральные свойства (характер роста на питательных средах)
биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов)
серологические свойства (антигенные)
вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии)
патогенность для животных
фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам)
чувствительность к антибиотикам
другие индивидуальные свойства
IV этап (Заключение)
По изученным свойствам делают заключение о выделенной культуре
Первый этап исследований. Исследование патологического материала начинается с микроскопии. Микроскопия окрашенного нативного материала позволяет установить ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта, некоторые морфологические особенности микроорганизмов. Результаты микроскопии нативного материала, во многом определяют ход дальнейшего исследования, впоследствии их сопоставляют с данными, полученными при посевах на питательные среды.
При достаточном содержании патогенных микроорганизмов в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие питательные среды обогащения. Питательные среды выбирают соответственно требовательности микроорганизмов.
Культивирование микроорганизмов возможно только при создании оптимальных условий их жизнедеятельности и соблюдении правил, исключающих контаминацию (случайное загрязнение посторонними микробами) исследуемого материала. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть стерильными и после посева микробного материала защищены от загрязнения извне, что достигается с помощью пробок или металлических колпачков и крышек. Манипуляции с исследуемым материалом должны проводится в зоне пламени спиртовки для исключения контаминации материала из внешней среды, а также в целях соблюдения техники безопасности.
Посевы материала на питательные среды должны быть сделаны не позднее 2 часов с момента их забора.
Второй этап исследований. Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки инкубации на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Таккак материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырастает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии,очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их (табл. 11). Прежде всего, изучают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет;полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная).
Таблица 11. Схема изучения колоний
|
Возможные характеристики колоний |
||
|
Плоская, выпуклая, куполообразная, вдавленная, круглая, розеткообразная, звездчатая |
||
|
Величина, мм |
Крупные (4-5 мм), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм), карликовые (< 1 мм) |
|
|
Характер поверхности |
Гладкая (S-форма), шероховатая (R-форма), слизистая (М-форма), исчерченная, бугристая, матовая, блестящая |
|
|
Бесцветные, окрашенные |
||
|
Прозрачность |
Прозрачные, непрозрачные, полупрозрачные |
|
|
Характер краев |
Ровные, зазубренные, бахромчатые, волокнистые, фестончатые |
|
|
Внутренняя структура |
Гомогенная, зернистая, неоднородная |
|
|
Консистенция |
Вязкая, слизистая, крошковидная |
|
|
Эмульгирование в капле воды |
Хорошо, плохо |
Примечание: 5-7 пункты изучаются при малом увеличении микроскопа.
Еще лучше можно увидеть различия колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого закрытую чашку дном кверху помещают на предметный столик, слегка опускают конденсор, используют небольшое увеличение объектива (х8), передвигая чашку, изучают у колоний микроскопические признаки: характер края (ровные, волнистые, зазубренные, фестончатые), структуру (гомогенная, зернистая, волокнистая, однородная, или различающаяся в центре и по периферии).
Далее изучают морфологию микробных клеток из колоний. Для этого из части каждой из отмеченных колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Во время взятия колоний обращают внимание на консистенцию (сухая, если колония крошится и берется с трудом; мягкая, если берется легко на петлю; слизистая, если колония тянется за петлей; твердая, если часть колонии не берется петлей, можно снять только всю колонию).
При просмотре мазков устанавливают, что колония представлена одним видом микроба, следовательно, могут быть выделены чистые культуры бактерий. Для этого из изученных колоний делают пересев на скошенный агар. При пересеве из колоний нужно тщательно следить, чтобы взять именно намеченные колонии, не задевая петлей близлежащих колоний. Пробирки подписывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов.
Третий этап исследований. Идентификация выделенной культуры. Идентификация микробов – определение систематического положения выделенной из материала культуры до вида и варианта. Первым условием надежности идентификации является безусловная чистота культуры. Для идентификации микробов используют комплекс признаков: морфологические (форма, размеры, наличие жгутиков, капсулы, спор, взаимного расположения в мазке), тинкториальные (отношение к окраске по Граму или другим методам), химические (соотношение гуанина+цитозина в молекуле ДНК), культуральные (питательные потребности, условия культивирования, темп и характер роста на различных питательных средах), ферментативные (расщепление различных веществ с образованием промежуточных и конечных продуктов), серологические (антигенная структура, специфичность), биологические (вирулентность для животных, токсигенность, аллергенность, влияние антибиотиков и др.).
Для биохимической дифференциации изучают способность бактерий сбраживать углеводы с образованием промежуточных и конечных продуктов, способность разлагать белки и пептоны и изучают окислительно-восстановительные ферменты.
Для изучения сахаролитических ферментов выделенные культуры засевают в пробирки с полужидкими средами, содержащими лактозу, глюкозу и другие углеводы и многоатомные спирты. На полужидкие среды посев делают уколом в глубину среды. При посеве уколом пробирку со средой держат под наклоном, вынимают пробку, обжигают край пробирки. Материал забирают стерильной петлей и прокалывают ею столбик питательной среды почти до дна.
Для определения протеолитических ферментов выделенную культуру засевают на пептонную воду или МПБ. Для этого в руку берут пробирку с посевом ближе к себе, а пробирку со средой - дальше от себя. Обе пробирки открывают одномоментно, захватив их пробки мизинцем и краем ладони, обжигают края пробирок, прокаленной охлажденной петлей захватывают немного культуры и переносят во вторую пробирку, растирают в жидкой среде на стенке пробирки и смывают ее средой.
При посевах и пересевах внимание должно быть обращено на соблюдение правил стерильности, для того, чтобы не загрязнять свои посевы посторонней микрофлорой, а также не загрязнять окружающую среду. Пробирки маркируют и помещают в термостат для инкубирования при температуре 37°Сна сутки.
Заключение
Учет результатов. Заключение по исследованию. Учитывают результаты идентификации и по совокупности полученных данных, опираясь на классификацию и характеристику типовых штаммов, описанных в руководстве (определитель Берджи, 1994-1996 гг.), определяют вид выделенных культур.
| " |
4.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Бактериологическая диагностика брюшного тифа и паратифов
А, В и С
Дата введения: с момента утверждения
1. РАЗРАБОТАНЫ: ФГУН
Санкт-Петербургский НИИЭМ им. Пастера Роспотребнадзора
(Л.А.Кафтырева, З.Н.Матвеева, Г.Ф.Трифонова); ГОУВПО
"Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им.
И.И.Мечникова" Федерального агентства по здравоохранению и
социальному развитию (А.Г.Бойцов).
3. УТВЕРЖДЕНЫ
Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека, Главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29 декабря 2007
г. 0100/13745-07-34
4. ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ с
момента утверждения.
5. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.
1. Область применения
1. Область применения
1.1. В методических
рекомендациях изложены основные принципы и особенности
бактериологической диагностики брюшного тифа и паратифов А, В и С;
содержатся современные сведения о биологических свойствах
возбудителей, резистентности к антибактериальным препаратам, о
питательных средах для их выделения и особенностях дифференциации
возбудителей брюшного тифа и паратифов от других серологических
вариантов сальмонелл.
2. Список сокращений
АБП - антибактериальный
препарат
ВСА - висмут-сульфит
агар
ЛПУ -
лечебно-профилактическое учреждение
МПК - минимальная
подавляющая концентрация
П
- промежуточный
У
- устойчивый
Ч
- чувствительный
РИФ - реакция
иммунофлюоресценции
ЦНС - центральная нервная
система
В
таблицах:
"+" - положительная
реакция в первые сутки;
"-" - отрицательная
реакция на 4-20 сутки;
"(+)" - замедленная
положительная реакция на 2-20 сутки;
d
- различные ферментативные реакции.
Возможна дифференциация
на ферментативные варианты.
3. Общие положения
3.1. Брюшной тиф и
паратифы А, В и С являются антропонозными кишечными инфекциями,
вызываемыми микроорганизмами Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi
A, Salmonella Paratyphi В и Salmonella Paratyphi С. В настоящее
время чаще регистрируется брюшной тиф, реже - паратиф В, редко -
паратиф А и крайне редко - паратиф С.
3.2. Заболевания
характеризуются язвенным поражением лимфатической системы тонкой
кишки, бактериемией, лихорадкой, циклическим клиническим течением с
выраженной интоксикацией, розеолезной сыпью на кожных покровах
туловища, гепато- и спленомегалией. Более характерен запор, нежели
диарея. Изъязвление пейеровых бляшек подвздошной кишки примерно в
1% случаев приводит к кишечному кровотечению и прободению кишечника
с самыми неблагоприятными последствиями для больного.
3.3. Диагноз брюшного
тифа и паратифов А, В и С ставится на основании клинических
признаков болезни с учетом эпидемиологического анамнеза и данных
комплексного лабораторного обследования, которое включает
классические бактериологический и серологический методы.
Бактериологическая диагностика имеет приоритетное значение, т.к. в
этом случае удается получить наиболее полную информацию о
биологических свойствах возбудителя, включая его чувствительность к
антибактериальным препаратам.
3.4. Применение
антимикробных препаратов для этиотропной терапии брюшного тифа и
паратифов позволило, с одной стороны, снизить летальность с 10-20%
до уровня менее 1%, а с другой стороны - осложнило лабораторную
диагностику, т.к. нередко забор материала для лабораторного
исследования осуществляется уже после начала антибиотикотерапии.
Этот факт заставляет более тщательно подходить к вопросу выбора
материала для исследования, взятия исследуемого материала, техники
исследования.
3.5. Современной
особенностью эпидемиологии брюшного тифа является резкое увеличение
частоты завоза (заноса) инфекции с эндемичных по этому заболеванию
территорий, стран ближнего и дальнего зарубежья, а также заражение
жителей России при выезде в эти страны и в процессе миграции внутри
страны. Другой особенностью является наличие обширного контингента
высокого эпидемиологического риска в виде лиц без определенного
места жительства, среди которых регистрируется высокая
заболеваемость брюшным тифом.
3.6. Данные методические
рекомендации составлены с целью унификации методов
бактериологической диагностики брюшного тифа и паратифов А, В и С,
а также правильной интерпретации результатов лабораторного
исследования с учетом современных особенностей клиники, лечения и
эпидемиологической обстановки на конкретных территориях.
4. Показания к проведению бактериологической диагностики
Показанием к проведению
бактериологического исследования биологического материала на
наличие возбудителей брюшного тифа и паратифов А, В и С является
необходимость обследования:
4.1) больных с
подозрением на тифопаратифозное заболевание, а также с лихорадкой
неясной этиологии, продолжающейся 5 и более дней;
4.2) лиц, общавшихся с
больными брюшным тифом и паратифами А, В, С;
4.3) работников отдельных
профессий, производств и организаций при поступлении на работу и по
эпидемиологическим показаниям;
4.4) лиц перед
поступлением в стационары и специализированные санатории по
клиническим и эпидемиологическим показаниям;
4.5) лиц при оформлении
на стационарное лечение в больницы (отделения)
психоневрологического (психосоматического) профиля, дома
престарелых, интернаты для лиц с хроническими психическими
заболеваниями и поражениями ЦНС, в другие типы закрытых учреждений
с круглосуточным пребыванием;
4.6) больных брюшным
тифом и паратифами после исчезновения клинических симптомов
перенесенного заболевания перед выпиской из стационара;
4.7) лиц, переболевших
брюшным тифом и паратифами, во время диспансерного наблюдения;
4.8) хронических
бактерионосителей, выявленных среди работников отдельных профессий,
производств и организаций, при повторном поступлении на работу на
указанные предприятия и объекты;
4.9) секционного
материала при подозрении на заболевание брюшным тифом и
паратифами.
5. Материально-техническое обеспечение метода
5.1. Стандартное
испытательное и вспомогательное оборудование, средства измерения
для микробиологических лабораторий.
5.2. Питательные среды,
диагностические сыворотки и химические реагенты для
культивирования, выделения, идентификации и определения
чувствительности к антибактериальным препаратам возбудителей
брюшного тифа и паратифов А, В и С.
5.3. Для лабораторной
диагностики тифо-паратифозных заболеваний и выявления
бактерионосителей должны использоваться питательные среды и
реагенты, разрешенные к применению на территории Российской
Федерации в установленном порядке.
6. Лабораторная диагностика брюшного тифа и паратифов
6.1. Принцип
бактериологического метода основан на обнаружении живых
микроорганизмов в различных биологических субстратах (кровь, моча,
кал, желчь, костный мозг, розеолы) в зависимости от стадии
заболевания. Для этого производят посев определенного количества
биологического материала на специальные питательные среды с
последующей инкубацией в термостате и идентификацией выросших
колоний микроорганизмов, характерных для S. Typhi, S. Paratyphi A,
S. Paratyphi В и S. Paratyphi С, по культурально-ферментативным
свойствам и антигенной характеристике.
6.2. Только
бактериологическое исследование может обеспечить точную постановку
этиологического диагноза и контроль освобождения организма от
возбудителя. В отношении дифференциальной диагностики брюшного тифа
и паратифов единственным методом является лабораторное исследование
биологического материала с выделением возбудителя и идентификация
его до уровня серологического варианта, т.к. клиническое течение
инфекционного процесса не всегда позволяет различить эти
нозологические формы.
7. Бактериологическое исследование
7.1. Выделение
возбудителей брюшного тифа и паратифов А, В и С проводят по одной и
той же схеме бактериологического исследования биоматериалов.
7.2. Порядок сбора
материала для лабораторных исследований на тифо-паратифозные
заболевания определен СП
3.1.1.2137-06 .
7.3. Техника сбора и
транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории
описана в МУ 4.2.2039-05 .
7.4. Материалом для
бактериологического исследования с целью диагностики брюшного тифа
и паратифов являются:
кровь;
испражнения;
моча;
Возбудители могут быть
также выделены из:
розеол;
костного мозга;
грудного молока.
Материалом для
бактериологического исследования с целью выявления
бактерионосителей, согласно СП
3.1.1.2137-06 , являются:
испражнения;
моча;
желчь (дуоденальное содержимое).
7.5. Исследование
секционного материала проводится с целью уточнения диагноза.
7.6. Сбор биологического
материала для лабораторных исследований осуществляется до начала
этиотропного лечения: медицинским работником, заподозрившим
тифо-паратифозную инфекцию; при групповой и вспышечной
заболеваемости - специалистами учреждений Роспотребнадзора и
персоналом лечебно-профилактических учреждений. От
госпитализируемых больных материал для бактериологического
исследования забирается в приемном отделении стационара.
7.7. От лиц, общавшихся с
больными или носителями (контактными), сбор материала проводится
медицинскими работниками ЛПУ и других организаций и учреждений по
месту выявления больных.
7.8. Биоматериал для
лабораторного исследования сопровождают специальным направлением.
Доставка материала самими обследуемыми не допускается. При
невозможности своевременной доставки материала используют
консерванты и транспортные среды (табл.1).
8. Бактериологическое исследование крови
Показанием к исследованию
крови является подозрение на тифо-паратифозные заболевания или
лихорадочное состояние невыясненного происхождения (лихорадка
неясного генеза), наблюдающееся в течение 5 и более дней (СП
3.1.1.2137-06).
Соотношение кровь -
питательная среда должно быть 1:10-1:60. Количество независимо
отбираемых проб крови и время их взятия определяется лечащим врачом
согласно МУ 4.2.2039-05 при
лихорадке неясного генеза или согласно МУ 04-723/3 МЗ СССР (1984)
при подозрении на тифо-паратифозные заболевания. У больных,
получающих антибактериальные препараты, пробы необходимо собирать
непосредственно перед введением (приемом) следующей дозы
препарата.
При наличии лихорадки
оптимальным является взятие крови на фоне повышения температуры
тела (но не на пике температуры!). Посев на питательные среды
проводят непосредственно у постели больного.
При подозрении на
тифо-паратифозные заболевания для посева крови можно использовать
среду Рапопорт, 20%-й желчный бульон, мясопептонный бульон с
добавлением 1%-й глюкозы (во флаконах по 100 мл). Ранее
использовали посев крови в стерильную дистиллированную
(водопроводную) воду. Однако предпочтительнее использовать
специальные среды для посева крови.
Количество засеваемой
крови в разгар лихорадки может составлять 10 мл, в более поздние
сроки - до 20 мл (у детей - до 5 мл).
При лихорадке неясного
генеза продолжительностью более 5 дней, как правило, должны
исследоваться несколько проб крови. Взятие крови из вены проводят
согласно МУ 4.2.2039-05 . Это
необходимо для дифференциации истинной бактериемии от случайной
контаминации крови при венопункции (вероятность загрязнения пробы
вследствие случайного прокола сальной или потовой железы составляет
3%). Для посева крови в этом случае используют две среды: 1) среду
для аэробов и факультативных анаэробов и 2) среду для облигатных
анаэробов (например, "двойная" среда + тиогликолевая среда согласно
приказу МЗ СССР от 12.04.85 N 535) или универсальную среду для
аэробов и анаэробов.
Предпочтительно
использовать промышленно произведенные среды, разрешенные к
применению в России.
Посевы инкубируют при 37
°С в течение 10 суток с ежедневным просмотром. При этом флаконы с
"двойной" средой наклоняют, омывая плотную часть среды.
При отсутствии признаков
роста на 10-й день выдается отрицательный ответ.
При наличии признаков
роста (помутнение, покраснение среды Рапопорт, появление видимых
колоний на плотной части "двойной" среды) проводят высев
параллельно на полиуглеводную среду и плотную среду в чашках Петри
(кровяной агар в случае лихорадки неясного генеза и среда Эндо при
подозрении на тифо-паратифозные заболевания).
Прямой высев на
полиуглеводные среды проводят для сокращения сроков исследования,
исходя из предположения, что при посеве крови с высокой
вероятностью будет наблюдаться рост монокультуры возбудителя. Для
контроля этого предположения и выделения чистой культуры путем
откола отдельных колоний необходим параллельный высев на среду Эндо
или кровяной агар.
Если на этих средах
наблюдается рост монокультуры, то можно учитывать биохимические
свойства по полиуглеводной среде. Для контроля чистоты культуры
необходимо провести микроскопию мазка с полиуглеводной среды,
окрашенного по Граму. На этом этапе возможна также постановка
реакции агглютинации на стекле с соответствующими агглютинирующими
О- и Н-сальмонеллезными сыворотками и выдача предварительного
ответа.
Схема бактериологического
исследования крови пациентов с подозрением на брюшной тиф и
паратифы представлена на рис.1.
Рис.1. Схема бактериологического исследования крови пациентов с подозрением на брюшной тиф и паратифы
Рис.1. Схема бактериологического исследования крови пациентов с подозрением на брюшной тиф и паратифы
Схема бактериологического
исследования крови пациентов при лихорадке неясного генеза
представлена на рис.2.
Рис.2. Схема бактериологического исследования крови пациентов с лихорадкой неясного генеза
Рис.2. Схема бактериологического исследования крови пациентов с лихорадкой неясного генеза
Ход дальнейшей
идентификации культуры по культурально-морфологическим,
ферментативным свойствам и серологической характеристике изложен
далее в соответствующих разделах.
9. Бактериологическое исследование испражнений
Пробы испражнений
отбирают сразу после дефекации из дезинфицированного и тщательно
вымытого судна, на дно которого был помещен лист плотной чистой
бумаги. Материал собирается с помощью ложки-шпателя,
вмонтированного в крышку стерильного контейнера. В отсутствие
контейнера со шпателем для отбора материала используют любой
стерильный инструмент (стерильный деревянный шпатель, проволочная
петля, ложечка и т.п.). При наличии патологических примесей
необходимо выбрать участки, содержащие слизь, гной, хлопья, но
свободные от крови. Образцы жидких испражнений отбирают с помощью
стерильной пластиковой пастеровской пипетки с замкнутым
резервуаром.
Объем забираемого
материала должен быть не менее 2 г. Оптимальным является взятие
материала в случае оформленного стула - в объеме грецкого ореха; в
случае жидкого стула его слой в контейнере должен быть не менее
1,5-2,0 см. Материал, помещенный в стерильный контейнер,
доставляется в лабораторию в течение 2 ч.
Если материал невозможно
доставить в лабораторию в течение 2 ч, его собирают в консервант
(транспортную систему со средой). Объем материала не должен
превышать объема среды.
Испражнения должны быть
тщательно гомогенизированы в среде. Образцы могут храниться до
начала исследования в течение суток в условиях холодильника (4-6
°С).
Транспортные среды и
консерванты, используемые для выделения возбудителей брюшного тифа
и паратифов А, В и С, а также других возбудителей острых кишечных
инфекций, представлены в табл.1.
Таблица 1
Транспортные среды и консерванты, наиболее часто используемые для транспортирования испражнений
|
Название
среды |
Обеспечивает сохранение |
|
среда
Кэрри-Блер |
всех кишечных патогенов, включая кампилобактерии |
|
среда
Эймс |
всех энтеробактерий |
|
среда
Стюарт |
сальмонелл и шигелл |
|
глицериновая
смесь |
всех
энтеробактерий, кроме иерсиний; предпочтительна для шигелл |
|
фосфатная
буферная смесь |
всех энтеробактерий |
|
боратно-буферный раствор |
всех энтеробактерий |
|
физиологический раствор |
всех энтеробактерий, включая кампилобактерии |
Пробы испражнений,
собранные непосредственно из прямой кишки с помощью ректального
тампона, используют преимущественно для объективизации диагноза
(МУ 4.2.2039-05). Взятие
материала осуществляется средним медицинским персоналом. Как
правило, специальный зонд для взятия мазка входит в состав
транспортной системы. Важно отметить, что попадание транспортных
сред на слизистую прямой кишки недопустимо! Поэтому ректальный
тампон должен погружаться в транспортную среду только после взятия
материала. Больного просят лечь на бок с притянутыми к животу
бедрами и ладонями развести ягодицы. Зонд-тампон вводят в задний
проход на глубину 4-5 см и, аккуратно вращая его вокруг оси,
собирают материал с крипт ануса. Осторожно извлекают зонд-тампон и
погружают его в транспортную среду. Транспортирование тампона без
среды не допускается.
В
лаборатории посев проб испражнений проводят непосредственно на
плотные дифференциально-диагностические питательные среды и
параллельно на среду обогащения.
Схема бактериологического
исследования испражнений представлена на рис.3.
Рис.3. Схема бактериологического исследования испражнений
Рис.3. Схема бактериологического исследования испражнений
Из нативных испражнений
готовят суспензию в 0,9%-м растворе хлорида натрия в соотношении
1:5-1:10, оставляют на 30 мин для оседания крупных частиц. После
этого одну каплю надосадочной жидкости засевают на чашки с плотными
питательными средами и 1 мл суспензии - в среду обогащения
(соотношение материал-среда должно быть 1:5).
Испражнения, доставленные
в лабораторию в консерванте (транспортной среде), перед посевом
должны быть тщательно гомогенизированы в среде, после чего проводят
прямой посев материала на плотные среды и среду обогащения в тех же
соотношениях, что и нативные испражнения.
Пробы испражнений,
собранные с помощью ректального тампона, исследуются аналогично
испражнениям, доставленным в консерванте. Следует помнить, что
ректальный тампон содержит меньшее количество микроорганизмов по
сравнению с нативными испражнениями, поэтому посевная доза должна
быть увеличена.
Максимальное выявление S.
Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi В и S. Paratyphi С в
испражнениях достигается при использовании сред обогащения, хотя у
больных в остром периоде заболевания возбудитель достаточно часто
выделяют и при прямом посеве. Посев на среды обогащения параллельно
с прямым высевом обязателен!
Все посевы инкубируют при
37 °С на дифференциально-диагностических средах 18-24 ч, на
висмут-сульфит агаре - 24-48 ч. Через 24 ч проводят высев со сред
обогащения на плотные среды (висмут-сульфит агар или среду Эндо).
Колонии, характерные для данных возбудителей, выросшие на плотных
средах, отсевают на полиуглеводную среду.
Необходимо отметить, что
техника распределения материала по поверхности чашки с плотными
средами должна обеспечить рост изолированных колоний типичного
вида, по которому можно визуально оценить культуральные свойства
микроорганизма.
Для выделения S. Typhi
предпочтительнее использовать висмут-сульфит агар (ВСА). Типичные
колонии S. Typhi имеют черный цвет и окружены черным или коричневым
ободком с металлическим блеском. Однако при обильном росте S. Typhi
часто не дает характерного почернения ВСА, поэтому чашки должны
быть засеяны так, чтобы обеспечить рост отдельных колоний.
Пробы фекалий можно
засевать на стандартные селективные среды для энтеробактерий,
разрешенные к применению на территории Российской Федерации. Тем не
менее, для выделения S. Турhi предпочтительнее всего использовать
висмут-сульфит агар. Ход дальнейшей идентификации культур по
ферментативным свойствам и серологической характеристике изложен
далее в соответствующих разделах.
10. Бактериологическое исследование мочи
Посев мочи производят для
диагностики с первых дней заболевания и вплоть до выписки больного,
а также с целью выявления бактерионосительства. Так как при тифе и
паратифах выделение возбудителя с мочой происходит периодически и
кратковременно, исследования мочи необходимо проводить повторно с
промежутками 5-7 дней.
Следует строго
придерживаться общих правил сбора мочи, изложенных в МУ 4.2.2039-05 . Вне зависимости от
способа получения мочи, она должна быть доставлена в лабораторию в
течение 2 ч. В крайнем случае допускается хранение мочи в течение
ночи в холодильнике.
Следует помнить, что в
зависимости от химического состава мочи бактерии в ней могут при
хранении как отмирать, так и размножаться.
Увеличение срока
сохранения материала может крайне затруднить интерпретацию
результата.
Производят прямой посев
мочи (или осадка после центрифугирования) без предварительного
обогащения согласно приказу МЗ СССР N 535 на плотные
дифференциально-диагностические среды, рекомендуемые для
сальмонелл, в том числе возбудителей брюшного тифа и паратифов.
Параллельно нативная моча засевается в среды обогащения двойной
концентрации в соотношении 1:1 или осадок мочи - в среды обычной
концентрации. Посевы помещают в термостат при 37 °С на 18-24 ч, а
затем со среды обогащения производят высев на плотные
дифференциально-диагностические среды. Колонии, выросшие на плотных
средах, идентифицируют по культурально-ферментативным и
серологическим свойствам.
11. Бактериологическое исследование желчи (дуоденального содержимого)
Желчь собирают в три
стерильные пробирки или стерильные одноразовые контейнеры раздельно
по порциям А, В, С согласно МУ
4.2.2039-05 и доставляют в лабораторию.
Проводят исследование
каждой порции (А, В, С) отдельно или готовят смесь из трех порций.
Пробы засевают:
на плотные дифференциально-диагностические
среды (ВСА, Эндо, ЭМС или др.) в количестве 0,5 мл;
в пробирку (флакон) с питательным бульоном
в соотношении 1:10. Нет необходимости засевать желчь на среды
обогащения, т.к. желчь сама является хорошей питательной средой для
возбудителей брюшного тифа и паратифов.
Засеянные среды вместе с
остатками желчи инкубируют при 37 °С.
Через 18-24 ч
просматривают посевы на плотных питательных средах (результаты
роста на ВСА учитывают через 24 и 48 ч) и делают пересев
подозрительных колоний на полиуглеводную среду.
Из питательного бульона
производят высевы на плотные дифференциально-диагностические
среды.
Из оставшейся желчи в
случае отрицательного результата прямого посева делают повторные
высевы на плотные дифференциально-диагностические среды через 18-24
ч и на 3, 5, 7 и 10 сутки.
Проводят идентификацию
выросших микроорганизмов по культурально-морфологическим,
ферментативным и серологическим свойствам.
12. Бактериологическое исследование материала из розеол
Бактериологическое
исследование ("соскоб" с розеол) проводят при наличии хорошо
выраженных розеол. Материал собирают асептически. Для этого участок
кожи над розеолами обрабатывают 70%-м этиловым спиртом, затем
протирают ватным тампоном, смоченным стерильным 0,9%-м раствором
хлористого натрия и осушают стерильным тампоном.
Материал для исследования
(тканевую жидкость) получают путем скарификации кожи над розеолой с
помощью скальпеля. На поврежденную кожу наносят 1-2 капли желчного
бульона или изотонического раствора хлорида натрия, смешивают с
выступившей тканевой жидкостью и собирают пастеровской пипеткой или
аналогичным одноразовым стерильным устройством в пробирку с одной
из жидких сред обогащения (желчный бульон, среда Рапопорт и др.). В
лаборатории посев выдерживают при 37 °С 18-24 ч с последующим
высевом на плотные дифференциально-диагностические среды (Эндо,
ЭМС, ВСА).
13. Бактериологическое исследование костного мозга
Хорошо известно, что при
лабораторном подтверждении диагноза "брюшной тиф" наиболее
результативным является бактериологическое исследование костного
мозга (высеваемость возбудителя составляет 90-95%). Даже у
пациентов с легкими и стертыми формами брюшного тифа, трудными для
клинического распознавания, а также на фоне приема антимикробных
препаратов, высеваемость миелокультур значительно выше, чем
гемокультур.
Однако на практике
бактериологическое исследование костного мозга проводится очень
редко, только по особым клиническим показаниям, при отсутствии
других лабораторных данных, подтверждающих диагноз брюшной тиф или
паратиф, т.к. эта инвазивная процедура достаточно травматична.
Забор материала для исследования проводят только в условиях
стационара при наличии соответствующего специалиста.
Материал для
бактериологического исследования (аспират) в количестве 0,50-0,75
мл получают асептически, путем проведения пункции грудины (рукоятки
или тела) и засевают в пробирку с одной из сред обогащения (желчный
бульон, среда Рапопорт и др.).
Если аспират невозможно
засеять в среду обогащения сразу после пункции, его собирают в
стерильную пробирку и немедленно направляют в лабораторию, где
производится посев в среду обогащения. В лаборатории посевы
инкубируют при 37 °С 18-24 ч с последующим высевом на плотные
дифференциально-диагностические среды.
Дальнейшее исследование
проводят, как при бактериологическом исследовании другого
биологического материала.
14. Питательные среды и реактивы
Перечень питательных сред
для выделения и идентификации возбудителей кишечных инфекций, в
частности энтеробактерий, обширен и неуклонно расширяется. Выбор
конкретных сред во многом обусловлен местными экономическими
условиями и традициями. Тем не менее, при этом следует
руководствоваться несколькими основными принципами.
14.1. В описании
питательной среды должно быть указано, что она может быть
использована не просто для выявления сальмонелл, а именно
Salmonella Typhi и S. Paratyphi А, В и С.
14.2. Следует отдавать
предпочтение сухим питательным средам известных производителей по
сравнению со средами, непосредственно изготовляемыми в
лаборатории.
14.3. Каждая партия
питательной среды в лаборатории должна контролироваться с помощью
тест-штаммов (внутренний контроль качества).
14.4. Для лабораторной
диагностики тифо-паратифозных заболеваний и выявления
бактерионосителей должны использоваться питательные среды и
реагенты, разрешенные к применению на территории Российской
Федерации в установленном порядке.
15. Методы изучения ферментативных свойств
В
настоящее время для изучения ферментативной активности
микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, включая возбудителей
брюшного тифа и паратифов, разработаны, выпускаются и
зарегистрированы различные диагностические тест-системы
отечественного и зарубежного производства (от наиболее простых
классических сред Гисса в пробирках и планшетах до автоматических
анализаторов). Если тест-системы позволяют идентифицировать
микроорганизм до уровня рода и выявлять особенности ферментативной
активности штаммов, то они могут быть использованы для
идентификации возбудителей брюшного тифа и паратифов. Методика
работы с тест-системами подробно изложена в инструкциях по
применению и их следует строго соблюдать.
16. Биологические свойства возбудителей
Возбудители брюшного тифа
и паратифов А, В и С относятся к семейству Enterobacteriaceae, роду
Salmonella, виду enterica, подвиду I (enterica) и обладают
морфологическими, культуральными и ферментативными свойствами,
характерными для данного подвида, вида, рода и семейства.
У
представителей рода сальмонелл вида enterica исторически сложилась
ситуация, когда для обозначения сероваров использовали не
антигенную формулу, как у других бактерий, а названия болезней
(человека или животных), страны, города или улицы, где они были
выделены, и др. Ошибочно считать эти названия видовыми, т.к. они не
имеют таксономического статуса. Тем не менее, названия наиболее
часто встречающихся сероваров сальмонелл настолько привычны, что
заменить их антигенными формулами практически нереально. Поэтому в
современной схеме Кауфмана-Уайта при обозначении сальмонелл только
вида enterica подвида I вместо видового обозначения используют
название серовара, но пишут его с заглавной буквы.
Таким образом, полные
названия возбудителей брюшного тифа и паратифов следующие:
Salmonella enterica subsp. enterica serovar
Typhi;
Salmonella enterica subsp. enterica serovar
Paratyphi A;
Salmonella enterica subsp. enterica serovar
Paratyphi B;
Salmonella enterica subsp. enterica serovar
Paratyphi С
В
обычной практике возможно использование сокращенных вариантов
названий:
Salmonella ser. Typhi или Salmonella Typhi
или S. Typhi;
Salmonella ser. Paratyphi А или Salmonella
Paratyphi А или S. Paratyphi A;
Salmonella ser. Paratyphi В или Salmonella
Paratyphi В или S. Paratyphi B;
Salmonella ser. Paratyphi С или Salmonella
Paratyphi С или S. Paratyphi С
16.1. Культурально-морфологические свойства
Подвижные
грамотрицательные палочки не образуют спор и капсул, факультативные
анаэробы хорошо растут на обычных питательных средах.
На простом питательном
агаре - слегка выпуклые с ровным краем и гладкой поверхностью,
влажные с блеском колонии более 1 мм.
На
дифференциально-диагностических средах (содержащих лактозу как
дифференцирующее вещество) - прозрачные, бесцветные или
голубоватые, а иногда розоватые или цвета среды колонии (среды
Эндо, Плоскирева, ЭМС и другие аналогичные среды).
На SS-arape - колонии
цвета среды с черным центром.
На висмут-сульфитной
среде - изолированные колонии S. Typhi, S. Paratyphi В - черные с
характерным металлическим блеском, среда под колонией прокрашена в
черный цвет. Колонии S. Paratyphi A - зеленоватые, светлые в цвет
среды, нежные.
Штаммы S. Paratyphi В
(возбудитель паратифа В) на мясопептонном агаре могут образовывать
по периферии колоний приподнятый слизистый вал. Слизистый вал
развивается на 2-5 сутки при хранении посевов при комнатной
температуре. Этот признак не является постоянным и
диагностическим.
16.2. Ферментативные свойства
Изучение ферментативных
свойств проводится в отношении набора углеводов, многоатомных
спиртов, аминокислот и других органических соединений, применяемых
при идентификации и изучении сальмонелл и других энтеробактерий.
Как правило, в практических лабораториях используют небольшое
количество тестов, позволяющих идентифицировать основные роды,
входящие в семейство кишечных бактерий. Характеристика
ферментативных свойств сальмонелл, включая возбудителей брюшного
тифа и паратифов А, В и С, представлена в табл.2.
Таблица 2
Ферментативные свойства возбудителей брюшного тифа и паратифов А, В, С
|
Субстрат |
S. Paratyphi
A |
||||
|
Глюкоза
(газ) |
Бактериологический метод включает бактериоскопию материала от больного, выделение чистой культуры возбудителя и его идентификацию с определением чувствительности к антибиотикам и химиопрепаратам.
Выбор материала
для исследования бактериоскопическим методом зависит от предполагаемой этиологии заболевания, стадии болезни с учетом ее патогенеза, биологических свойств возбудителя и других моментов.
1. При инфекционных болезнях
, протекающих с бактериемией (брюшной тиф, генерализованные и септические формы сальмонеллеза); при сепсисе любой этиологии, вызываемом не только гноеродной кокковой микрофлорой, синегнойной палочкой, но и более редкими ее возбудителями (Serratia Salinaria, неферментирующие бактерии, анаэробы, L-формы стрептококка (метод Сукнева) и другие микроорганизмы), прибегая в этих случаях к посевам на специальные питательные среды. Следует подчеркнуть, что успех частоты и спектр выделяемых возбудителей из крови и других биологических секретов больного зависят от эрудиции, пытливости, настойчивости и упорства работников бактериологической лаборатории.
2. Спинномозговая жидкость (гнойные менингиты; туберкулезный менингит при длительном выращивании (более месяца) на специальных для выделения туберкулезных бактерий питательных средах.
3. Мокрота (острые пневмонии и трахеобронхиты, туберкулез, коклюш, чума, редкие формы брюшного тифа (пневмотиф), легионеллез, респираторный микоплазмоз и хламидиозы).
4. Слизь, гной с миндалин (стрептококковые и стафилокковые ангины).
5. Налет и слизь с миндалин
, из зева и носа, отделяемое с конъюнктивы, половых органов (дифтерия).
6. Соскоб со слизистой носа (проказа).
7. Отделяемое из носа и ротоглотки (синуиты, озена, риносклерома).
8. Отечная жидкость, кусочки пораженных мышц, некрозированные ткани (анаэробные инфекции); отделяемое ран (ботулизм; в случае необходимости и столбняк).
9. Пунктат из увеличенных лимфоузлов (туберкулез, токсоплазмоз).
10 Содержимое карбункула и пунктат из нагноившихся лимфоузлов (чума, туляремия, септикопиемия, сибирская язва).
Бактериологические исследования при особо опасных инфекциях (чума, туляремия, бруцеллез, холера (при которой исследуются только испражнения(!)) выполняются в специальных режимных лабораториях, исключающих возможность самозаражения ее сотрудников при работе с бактериальными культурами и распространение возбудителей за пределы этих лабораторий.
Серологические исследования . Внедрены в клинику несколько позднее бактериологического метода, предложенного Р. Кохом. В 1896 г. Ф. Видаль обнаружил, что сыворотки крови больных брюшным тифом к концу 1-й недели болезни приобретают способность агглютинировать брюшнотифозную палочку - возбудителя брюшного тифа (положительная реакция Видаля). При полимикробной этиологии инфекционных болезней после открытия Видаля стали также прибегать к определению титров сывороточных агглютининов к выделяемым из патологического материала нескольким видам бактерий (реакция аутовидаля) и контролировать их динамику в зависимости от стадии болезни. Наиболее высокие титры агглютининов к одному из видов выделенных бактерий свидетельствуют в пользу его большей этиологической причастности к развитию болезни.
Уже в начале применения реакции Видаля в клинике было замечено, что самые тяжелые формы, например, брюшного тифа могут протекать при отсутствии в крови агглютининов (отрицательная реакции Видаля), что указывает на относительную диагностическую ценность этого метода как при брюшном тифе, так и при других инфекционных болезней. Позднее он был заменен более чувствительными серологическими методами. Но приоритетное значение открытия Видаля останется навсегда.
В настоящее время для серологической диагностики бактериальных инфекций применяют более чувствительные методы, когда антиген бактерий сорбируют на поверхности эритроцитов (эритроцитарные диагностикумы1). Таким образом, были разработаны принципиально новые серологические реакции: прямой (РПГА) и непрямой гемагглютинации (РИГА). Они широко применяются для серологической диагностики многих бактериальных, вирусных и других инфекций (брюшного тифа, сальмонеллеза, шигеллезов, бруцеллеза, туляремии и др.). Сохраняет свое диагностическое значение реакция преципитации при некоторых заболеваниях (ботулизме и сибирской язве - реакция Асколи для ее диагностики у животных). В серодиагностике особенно широко в настоящее время применяется реакция связывание комплемента (РСК), предложенная в 1901 г. французскими исследователями Борде и Жангу (сифилис, гонорея, бруцеллез, токсоплазмоз, туберкулез, проказа, сап). РСК имеет наибольшее значение для серодиагностики вирусных инфекций (грипп, другие ОРВИ, герпес, энцефалит, эпидемический паротит, орнитоз и др.), а также многочисленных риккетсиозов.
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: знать принципы культивирования микроорганизмов, питательные среды, их классификация; методы стерилизации и дезинфекции, применяемые в микробиологии и медицине; этапы бактериологического метода диагностики инфекционных заболеваний.
уметь пользоваться аппаратурой для культивирования бактерий (аэробов и анаэробов), выбрать средства, режим стерилизации и дезинфекции в соответствии с конкретными задачами, проводить 1 этап бактериологического метода диагностики инфекционных заболеваний (посевы исследуемого материала на плотные и жидкие питательные среды с целью выделения чистых культур аэробных микроорганизмов).
1. Вопросы для самоподготовки:
1. Состав и требования, предъявляемые к питательным средам
2. Классификация питательных сред
3. Асептика и антисептика
4. Дезинфекция, методы и контроль эффективности дезинфекции
5. Стерилизация, методы, аппаратура и режимы стерилизации
6. Методы определения эффективности стерилизации
7. Вид, штамм, колония, чистая культура микроорганизмов
8. Методы выделения чистых культур микроорганизмов
9. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Цель и последовательность выполнения 1 этапа бактериологического метода выделения аэробов
10. Техника посева микроорганизмов на жидкие и плотные питательные среды
11. Особенности культивирования анаэробных микроорганизмов. Аппаратура и оборудование, используемая для культивирования анаэробных бактерий
2. Контрольные вопросы:
1) Выписать требования, предъявляемые к питательным средам
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2) Выписать классификацию питательных сред
а) по консистенции (с примерами, указать концентрацию агар-агара): ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
б) по целевому назначению (дать определение, привести примеры)
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
3) Выписать методы стерилизации
а) с использованием высоких температур ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
б) без использования высоких температур ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
4) Перечислить аппаратуру для стерилизации ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
5) Выписать в тетрадь а) методы контроля режима стерилизации
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
б) методы контроля стерильности питательных сред ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
в) методы контроля стерильности инструментов, перевязочного, шовного материала и др. ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
6) Перечислить все методы культивирования аэробов
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
7) Перечислить все методы культивирования анаэробов
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
8) Изучить схему бактериологического метода диагностики, назвать этапы метода
Выписать цель и схему бактериологического метода исследования
ЦЕЛЬ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
СХЕМА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Ознакомиться с питательными средами и заполнить таблицу «Питательные среды».
Заполните таблицу «Основные методы стерилизации»
| Метод стерилизации | Аппаратура | Режим стерилизации: температура, давление, однократно или дробно (сколько раз) и др. | Надежность: полное обеспложивание или остаются жизнеспособные микроорганизмы (споры, вирусы) | Стерилизуемые материалы |
| 1. Прокаливание | ||||
| 2. Кипячение | ||||
| 3. Паровая стерилизация паром под давлением | ||||
| 4. Паровая стерилизация текучим паром | ||||
| 5. Воздушная стерилизация (сухим жаром) | ||||
| 6. Пастеризация | ||||
| 7. Ионизирующая радиация | ||||
| 8. УФ-облучение | ||||
| 9. Фильтрование | ||||
| 10. Газовая стерилизация | ||||
| 11. Химические растворы |
Базовый текст
Состав и требования, предъявляемые к питательным средам
Питательные среды необходимы для получения чистых культур микроорганизмов, изучения особенностей их морфологии и физиологии, а также для сохранения микроорганизмов в виде чистых культур в лабораторных и производственных условиях.
Питательная среда должна удовлетворять следующим требованиям:
1. Питательность (полноценность) - содержание необходимых для жизнедеятельности микробов факторов – источников углерода, азота, серы, источников энергии, необходимых неорганических ионов в форме доступной для усвоения микроорганизмами.
2. Изотоничность, создаваемая 0,85% NaCl (концентрация солей в питательной среде должна соответствовать их концентрации в микробной клетке).
3. Оптимальные значения ряда биохимических показателей: концентрации водородных ионов (диапазон рН 4,5-8,5, обычно 7,2-7,4), окислительно-востановительного потенциала (Eh для анаэробов – низкий 0,0120-0,060 В, для аэробов – высокий более 0,080 В), осмотического давления.
4. Иметь достаточную влажность (не менее 60% для плотных сред), так как микробы питаются по законам диффузии и осмоса.
5. Определенная вязкость (наиболее оптимальная для диффузии веществ).
6. Прозрачность, для визуализации роста бактерий.
7. Стерильность.
Компоненты питательных сред
Источником азота для микроорганизмов являются белки, но большинство микробов неспособны усваивать нативный белок, поэтому используются продукты кислотного и ферментного расщепления белка: пептон, казеин. Исходными компонентами искусственной питательной среды является мясная вода, кислотный и ферментный гидролизат казеина, пептон, также к основе добавляют хлорид натрия. Мясная вода содержит минеральные вещества, углеводы, витамины. Казеин пищевой кислотный является отходом молочной промышленности, содержит полноценный набор аминокислот и характеризуется высокой питательностью. Пептон – это продукт неполного переваривания белка, получаемый путем ферментного или кислотного гидролиза отходов производства мясных или рыбных продуктов или молочного казеина. Содержит альбумозы, пептоны и полипептиды аминокислот в незначительном количестве, состав их зависит от глубины расщепления белка. Пептон представляет собой порошок светло-желтого цвета, хорошо растворяется в воде, не свертывается при нагревании. Используется как источник азота и углерода.
Плотные питательные среды готовят из жидких с добавлением уплотнителя. В качестве уплотнителя обычно применяют агар-агар. Агар-агар – продукт, получаемый из морских водорослей, представляет собой желтоватый порошок или пластинки, содержит высокомолекулярные полисахариды, не расщепляется большинством микроорганизмов, не разрушается при автоклавировании, питательную ценность сред не изменяет, не подавляет рост микробов. Он способен образовывать в воде гели, плавящиеся при 100°С и уплотняющиеся при 45°С и ниже, не используемые микроорганизмами в качестве питательного субстрата. Несколько циклов плавления и затвердевания не влияют на способность агара образовывать гель, поэтому агаровые среды можно несколько раз стерилизовать.
Также в состав питательных сред включают кровь, сыворотки, неорганические соли. Все питательные среды, как правило, содержат 0,5 % хлористого натрия, что соответствует изоосмотическим условиям среды, оптимальным для жизнедеятельности микробов. Функцией минеральных элементов в метаболизме микробов является в основном активация различных ферментов. Кроме того, неорганические ионы (в основном Na+ и К+) участвуют в транспорте веществ через клеточные мембраны, в регуляции синтеза белка.
Восстанавливающие вещества. Восстанавливающие вещества добавляют в среды, предназначенные для культивирования анаэробных микроорганизмов, чтобы снизить окислительно-восстановительный потенциал (Eh) и сбалансировать его на оптимальном уровне. Eh - это мера способности раствора отдавать или принимать электроны. При культивировании анаэробов в качестве восстановителей обычно применяют тиогликолят натрия (0,1 %), цистеин (0.1%), аскорбиновую кислоту (0,1 %).
Углеводы, многоатомные спирты, индикаторы . Углеводы являются наилучшим источником углерода для большинства гетеротрофных микроорганизмов. Они входят в состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для определения биохимических свойств микробов.
В состав питательных сред, кроме углеводов и многоатомных спиртов, входят различные индикаторы , в основном кислотно-основные. Изменение цвета среды при посеве микроорганизмов указывает на образование кислоты или щелочи при ферментативной активности микроорганизмов. В качестве индикаторов обычно используют нейтральный красный, бромтимоловый синий, конго красный, смесь розоловой кислоты и водно-голубого (ВР), индикатор Андреде.
Красители. Способность красителей легко и обратимо переходить из окрашенной формы в восстановленную (бесцветную) широко используется в бактериологической практике, в частности, для дифференциации бактерий, разлагающих лактозу, от лактозоотрицательных. В результате указанного процесса лактозоположительные бактерии образуют на среде окрашенные колонии, а лактозоотрицательные – бесцветны. Наиболее употребительными красителями, входящими в состав питательных сред, являются основной фуксин, метиленовая синь и эозин.
Ингибиторы. При исследовании на наличие патогенных бактерий необходимо подавить рост сопутствующей микрофлоры. С этой целью используют различные ингибиторы. В качестве ингибиторов грамотрицательных микроорганизмов в состав сред входят тетратионат натрия и калия, теллурит калия, ацетат таллия, сульфат таллия, селенит натрия. Для угнетения роста грамположительных микробов используются анилиновые красители: бриллиантовый зеленый, кристаллический фиолетовый, этиловый фиолетовый, анилиновый синий. Желчь и соли желчных кислот входят в состав селективных сред для выращивания патогенных энтеробактерий. Смесь желчных кислот, получаемая в результате щелочного гидролиза желчи, входит в состав среды Плоскирева. За рубежом в составе селективных сред используют соли отдельных желчных кислот, в основном дезоксихолат натрия.
Сухие питательные среды. Приготовление питательных сред - один из наиболее ответственных участков работы бактериологической лаборатории. В связи с этим биопромышленность выпускает стандартные, консервированные, сухие питательные среды, различного назначения, для культивирования микроорганизмов. Они представляют собой гигроскопические порошки с влажностью до 10%. Готовят среды по прописи, указанной на этикетке. Постоянство состава, стандартность среды, простота и удобство в работе, легкость транспортировки и хранения являются большим преимуществом сухих питательных сред. После установления соответствующего рН среду кипятят, фильтруют, осветляют, разливают во флаконы, пробирки и стерилизуют. Следует учитывать, что после стерилизации среда становится более кислой.
Суть бактериоскопического метода: обнаружение микробов в исследуемом материале; изучение их морфологических и тинкториальных свойств, характер расположения в бактериологическом мазке в поле зрения.
Техника выполнения. Материал от больного визуально изучается, выбирается порция, в которой с наибольшей долей вероятности может быть обнаружен возбудитель заболевания (комочки слизи, гнойные пробки). Он наносится на предметное стекло (иногда материал предварительно эмульгируется в физиологическом растворе, реже подвергается центрифугированию). Капля распределяется по стеклу, высушивается и фиксируется. После этого мазок окрашивается, и препарат просматривается под микроскопом. Обычно мазок окрашивается по Граму. Иногда, как наиболее щадящий, применяется один из простых методов окраски, тогда препарат красится одним красителем (например, при диагностике менингококковой инфекции, холеры).
При необходимости используются специальные сложные методы окраски, например метод Бурри-Гинса для выявления капсульных микроорганизмов или метод Циля-Нильсена для выявления наличия кислотно-устойчивых бактерий. В отдельных случаях (в частности, при изучении двигательной активности микроорганизмов) готовят препараты «висячая капля» и «раздавленная капля» и микроскопируют неокрашенные бактерии.
Достоинства бактериоскопического метода: простота исполнения, возможность быстрого получения результатов, техническая и экономическая доступность.
Недостатки метода: для определения вида микроорганизмов зачастую бывает недостаточным определение его морфологических свойств, так как они идентичны у представителей родственных видов. Кроме того, бактерии с характерной морфологией нередко подвергаются изменениям, особенно под действием антибиотиков, и становятся неузнаваемыми; наконец, концентрация возбудителей в исследуемом материале может быть чрезвычайно низкой, и тогда их трудно обнаружить.
С учетом вышеуказанного, бактериоскопический метод редко используется как единственный и окончательный способ установления этиологии заболевания. Чаще он применяется как ориентировочный, предварительный, а при диагностике некоторых инфекционных заболеваний он вообще не предусматривается.
Как понимать ориентировочность и предварительность? Это касается врача-клинициста и врача-бактериолога. Клиницист, получая предварительный ответ (положительный или отрицательный), в большей или меньшей степени использует полученную информацию в своих дальнейших исследованиях до получения окончательного результата бактериологического метода диагностики. Бактериолог, получив ориентировочные сведения о подозреваемом возбудителе, о его концентрации в используемом материале, о наличии сопутствующей микрофлоры, определяет способы обработки материала и выделения чистой культуры возбудителя, выбирает питательные среды для последующего культивирования.
Бактериологический метод
Суть метода - выделение чистой культуры микроба - возбудителя из патологического материала, подробное изучение его морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, серологических свойств с целью последующей идентификации возбудителя. При осуществлении бактериологического метода исследования выделяют 4 этапа.
А. Учитывая данные, полученные при бактериоскопическом исследовании, осуществляется выбор максимально эффективных питательных сред, на которых с наибольшей долей вероятности удастся получить рост культуры предполагаемых микробов - возбудителей.
Б. Производится посев исследуемого материала на ряд питательных сред: жидких и плотных, универсальных, элективно-селективных, дифференциально-диагностических. При этом посев на чашки Петри с плотными питательными средами производится бактериологической петлей штрихом с целью обеспечить возможность получения роста изолированных друг от друга колоний микробов (можно пользоваться также способом Дригальского или другим методом разобщения культур микроорганизмов).
А. Изучаются культуральные свойства выросших на питательных средах микроорганизмов; производится отбор подозрительных колоний. Следует подчеркнуть, что отбор подозрительных колоний - самый ответственный и трудный этап работы. Он основан, прежде всего, на определении характерных особенностей колоний микробов, но зачастую это не позволяет дифференцировать колонии микробов отдельных видов и приходится дополнительно изучать морфологию микробов в мазках из подозрительных колоний, особенности роста микроорганизмов на дифференциально-диагностических средах и т.д. Выделение чистых культур бактерий и их изучение можно осуществлять, проводя предварительный посев на жидкие среды накопления, но при этом затрачивается дополнительное время исследования.
Б. Из подозрительных колоний готовится бактериологический мазок, окрашивается по Граму и микроскопируется (устанавливается идентичность микроорганизмов с изученными при микроскопическом исследовании на 1-ом этапе). В. Из оставшейся части подозрительной колонии производится пересев культуры на скошенный мясопептонный агар (можно использовать и другие питательные среды, на которых предполагается хороший рост выделенных микроорганизмов). Цель - накопление чистой культуры микроба - предполагаемого возбудителя заболевания, т.к. на следующем этапе исследования потребуется много микробной массы.
У предполагаемого возбудителя изучаются сахаролитические свойства (производится посев на среды пестрого ряда, среды Олькеницкого, Ресселя и др.), протеолитическая активность (посев на желатин, молоко по Тукаеву, определение образования индола и сероводорода при росте на мясопептонном бульоне). Исследуется чувствительность выделенных культур к антибиотикам (чаще методом стандартных бумажных дисков, реже - методом серийных разведений). Производится серотипирование в реакции агглютинации на стекле с групповыми и типовыми диагностическими сыворотками; фаготипирование со стандартными диагностическими бактериофагами. Для идентификации в некоторых случаях изучаются факторы патогенности у бактерий.
Производится учет результатов проведенных исследований. На основании сопоставления выявленных у микроорганизмов свойств (морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, серологических и т.д.) осуществляется идентификация микробов. Выдается окончательный ответ с результатами бактериологического исследования, где указывается вид возбудителя (иногда - его серотип, биовар, фаготип) и его чувствительность к антибиотикам.
Довольно часто для получения достоверных результатов выдаче ответа предшествуют биологический, аллергологический или другие методы исследования.
Достоинства бактериологического метода диагностики: высокая достоверность результатов исследования; возможность получения дополнительных данных о чувствительности выделенных возбудителей к антибиотикам; возможность проведения эпидемиологических исследований.
К недостаткам метода можно отнести длительность исследования (не менее 4-5 дней), а также невозможность его использования в тех случаях, когда возбудители (например, риккетсии, хламидии) инфекции не растут на искусственных питательных средах.
Биологический метод
В некоторых случаях для оптимизации диагностики инфекционных заболеваний применяется биологический метод (биопроба), предусматривающий заражение лабораторных животных. При этом перед исследователем могут стоять различные цели:
Воспроизведение клинической и патологоанатомической картины заболевания (например, при диагностике столбняка, лептоспироза);
Выделение в короткие сроки чистой культуры возбудителя (при диагностике пневмококковой инфекции);
Определение вирулентности и патогенности возбудителя (при диагностике туберкулеза);
Определение вида и типа токсинов (при диагностике ботулизма)
Для диагностики инфекционных заболеваний используют различных животных. Выбор их определяется видовой восприимчивостью к различным этиологическим агентам. Например, мыши чувствительны к пневмококковой инфекции, сибиреязвенной, столбнячной; морские свинки - к возбудителям туберкулеза, бруцеллеза, туляремии; кролики - к стафилококкам, стрептококкам, ботулизму. Для исследования отбираются только здоровые животные определенного возраста и массы тела.
Перед введением материала животных фиксируют. Мелких животных держит экспериментатор, для крупных используют специальные приспособления. Место введения инфецированного материала обрабатывают спиртом или йодом. Инфицированный материал вводят в зависимости от особенностей патогенеза изучаемого заболевания подкожно, накожно, внутривенно, внутрибрюшинно, интрацеребрально и т.д.
При накожном методе заражения предварительно выстригают шерсть, скарифицируют кожу, после чего втирают в неё материал.
Подкожный метод: кожу животных захватывают в складку, лучше пинцетом, вводят иглу до половины, после инъекции накладывают ватку со спиртом и извлекают иглу.
Внутримышечный метод: материал вводят в мышечную ткань верхней части задней конечности.
Внутрибрюшинный метод: животное держат вниз головой, чтобы не поранить кишечник. Инъекцию делают в нижней части живота, сбоку от средней линии. Брюшную стенку прокалывают толчкообразным движением, шприц под прямым углом.
Внутривенный метод: мышам, крысам вводят материал - в хвостовую вену или внутрисердечно. Кролику вводят - в ушные вены, которые поверхностно расположены и хорошо видны (лучше пунктировать наружную вену). Место введения после инъекции зажимают ватой со спиртом, чтобы не было кровотечения. Морским свинкам при внутрисердечном заражении вкалывают иглу на высоте «толчка» сердца в межреберный промежуток. Если игла введена правильно, в шприце появится кровь.
Подготовка инструментов и материалов: шприцы, скальпели, иглы стерилизуются кипячением. В шприц набирают материал (немного больше, чем необходимо ввести), поворачивают вертикально вверх, покрывают иглу стерильной ваткой и выталкивают поршнем из шприца пузырьки воздуха. Эту манипуляцию проводят над дезраствором.
При диагностике инфекций, обусловленных действием токсина (ботулинического, сибиреязвенного) материал, предположительно содержащий возбудителя и токсины, помещают в физиологический раствор, затем фильтруют через бумажный фильтр, натертый тальком (он хорошо адсорбирует токсин). Чувствительных животных заражают смывами с фильтров. В некоторых случаях, когда патогенез заболевания обусловлен патогенными свойствами самого возбудителя, животных заражают микробной взвесью.
Зараженных белых мышей маркируют и помещают в специальные стеклянные банки; на них наклеивается бирка с указанием даты заражения и вида микроорганизма, с которым проводилась работа. Точно так же подписывают клетки с зараженными кроликами или морскими свинками. За животными наблюдают. В случае гибели их сразу же вскрывают.
Перед вскрытием белых мышей животных предварительно умерщвляют парами эфира. Мышей ненадолго погружают в дезраствор и затем фиксируют в кювете брюшком вверх за лапы. Отмечают наличие или отсутствие внешних патологических изменений. Разрез кожи делается продольно от лобка до нижней челюсти и поперечно - по направлению к конечностям. Отмечают изменения в кожной клетчатке и состояние лимфоузлов. Из последних делают мазки-отпечатки. Для осмотра грудной полости удаляют грудину, надрезав ножницами ребра с обеих сторон. После внешнего осмотра отрезают кусочки сердца и помещают в МПБ. Делают посев непосредственно на МПА мазки-отпечатки из сердца, легких.
Вскрывают брюшную полость, при внешнем осмотре отмечают состояние внутренних органов (величину, цвет, консистенцию, наличие гнойных очагов). Делают посевы печени, селезенки и мазки отпечатки.
Работа проводится стерильными инструментами, после каждого взятия органа пинцет и ножницы опускаются в стакан со спиртом и обжигают.
После вскрытия труп и кювету, где производилось вскрытие, заливают дезраствором на сутки.
Посевы инкубируют в течение 24 часов (при необходимости и более) при
t 37 о С. Затем их просматривают, выделяют чистую культуру возбудителя и осуществляют его идентификацию при помощи бактериологического метода.
Достоинства метода: достоверность полученных результатов, отсутствие необходимости в сложной аппаратуре.
Недостатки: дороговизна, ограниченность применения, опасность инфицирования.
Похожая информация.